12. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам (качественные и количественные).

Для определения чувствительности бактерий к антибиотикам (антибиотикограмма) обычно применяют:

- методы диффузии в агар. На агаризованную питательную среду засевают исследуемую чистую культуру микроба, а затем вносят антибиотики. Обычно препараты вносят или в специальные лунки в агаре (количественный метод), или на поверхности посева раскладывают диски с антибиотиками (метод дисков - качественный метод). Результаты учитывают через сутки по наличию или отсутствию роста микробов вокруг лунок (дисков);

- методы определения минимальных ингибирующих (МИК) и бактерицидных (МБК) концентраций, т.е. минимальный уровень антибиотика, который позволяет in vitro предотвратить видимый рост микробов в питательной среде или полностью ее стерилизует. Это количественные методы, которые позволяют рассчитать дозу препарата, так как при лечении концентрация антибиотика в крови должна быть значительно выше МИК для возбудителя инфекции. Введение адекватных доз препарата необходимо для эффективного лечения и профилактики формирования устойчивых микробов. Существуют ускоренные способы с применением автоматических анализаторов.

Молекулярно-генетические методы (ПЦР и др.) позволяют исследовать геном микробов и обнаружить в нем гены резистентности.

• Качественные методы: дискодиффузионный и др.

• Количественные методы: серийных разведений и др.

Дискодиффузионный метод. Бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар, после чего на его поверхность пинцетом помещают на равномерном расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37°С в течение суток. По диаметру зон задержки роста культуры судят о ее чувствительности к соответствующим антибиотикам. Однако диско-диффузионный метод позволяет лишь косвенно судить о величине МПК, в результате микроорганизм относят к одной из категорий чувствительности: чувствительный, промежуточный или резистентный.

Е-тест. Е-тест представляет собой узкую полимерную полоску, на которую нанесен градиент АБП (от минимальных до максимальных). Подавление роста микроорганизмов вокруг полоски Е-теста происходит в той зоне, где концентрация АБП, диффундирующего из полоски, выше МПК, при этом образуется каплевидная зона ингибиции. Величину МПК учитывают в том месте, где граница зоны подавления роста плотно подходит к полоске, на которой нанесены концентрации АБП. Дает возможность определить минимальную ингибирующую концентрацию антибиотика.

Метод серийных разведений антибиотиков. Для этого определенные концентрации АБП вносят в питательную среду, в которую затем засевают исследуемый микроорганизм. После инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста. В зависимости от типа используемой питательной среды различают методы серийных разведений в агаре или бульоне. Позволяет более точно определить МИК, однако из-за громоздкости применяется реже.

На антимикробную активность in vitro влияют:

- рН среды;

- компоненты среды;

- концентрация микроорганизмов;

- условия и время культивирования.

На антимикробную активность препаратов in vivo влияют:

- фармакодинамику препарата в организме (скорость всасывания, выведения, расщепления и т.д.);

- локализацию микробов в организме (особенно внутриклеточную локализацию).

Для оценки чувствительности необходимо использовать только специально предназначенные для этой цели среды (агар Мюллера-Хинтон).

• Перед разливом расплавленного агара чашки Петри помещают на горизонтальную поверхность, выверенную по уровню. Расплавленный агар разливают в чашки в таком количестве, чтобы величина его слоя в чашке составляла 4-5 мм (на чашку диаметром 10 см требуется 25 мл агара). Перед посевом чашки подсушивают в термостате.

• Посевной материал должен представлять бактериальную суспензию с концентрацией бактерий, равной 1,5х108 КОЕ/мл, оптическая плотность данной концентрации соответствует стандарту мутности 0,5 по стандарту Мак-Фарланда. Для приготовления такой суспензии отбирают несколько однотипных, четко изолированных колоний исследуемой культуры, выращенной на неселективной питательной среде. Петлей переносят незначительное количество материала с верхушки колонии в пробирку со стерильным физиологическим раствором, доводя плотность суспензии до 0,5 по стандарту Мак-Фарланда. Приготовленную суспензию можно использовать в течение 15 мин после приготовления. Наиболее удобный способ посева - использование стерильных ватных тампонов. Тампон погружают в приготовленную суспензию исследуемого микроорганизма, избыток суспензии удаляют, отжимая тампон о стенку пробирки. Посев проводят штриховыми движениями в трех направлениях, поворачивая чашку Петри на 60°.

• Не позднее 15 мин после посева на поверхность питательной среды наносят с помощью стерильного пинцета диски с АБП. Расстояние диска от края чашки и между дисками должно составлять 15-20 мм. На одну чашку помещают не более 6 дисков.

• После аппликации дисков чашку Петри помещают в термостат дном вверх. Инкубацию проводят при температуре 35 °С в течение 18-24 ч.

• По окончании инкубации измеряют диаметр зоны ингибиции роста, выражая его в миллиметрах.

• Интерпретация результатов оценки антибиотикочувствительности заключается в отнесении исследуемого микроорганизма к одной из трех категорий: чувствительный, промежуточный, устойчивый.

• Для интерпретации результатов на основании сопоставления результатов исследования (диаметра зоны ингибиции роста) с пограничными значениями этого параметра, отделяющего чувствительные штаммы от промежуточных и промежуточные от устойчивых, используют специальные таблицы.