Микробиологическая диагностика.
Исследуемым материалом в зависимости от локализации поражения служат кровь, гной, слизь из зева, налет с миндалин. Из полученного материала готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. При обнаружении грамположительных кокков, расположенных в цепочках, производят посев на чашки с кровяным агаром. Основной метод диагностики - бактериологический. Из выросших на кровяном агаре блестящих вязких колоний с зоной гемолиза делают мазки и окрашивают их по Граму. При наличии грамположительных стрептококков определяют каталазную активность бактерий. У стрептококков каталазный тест должен быть отрицательным.
Серогруппу выделенных стрептококков определяют с помощью реакции преципитации в геле или ИФА с группоспецифическими сыворотками. Серотип стрептококков определяют путем постановки реакции латекс-агглютинации с М-антисывороками. Для диагностики ревматической лихорадки и оценки активности ревматического процесса определяют титр антител к стрептолизину О (ASO-тест) с помощью специального набора.
При эпидемиологическом надзоре за стрептококковой инфекцией дополнительно проводят такие исследования выделенных культур как М- и emmтипирование, OF-типирование, Т- и tee-типирование, мультилокусное сиквенсное типирование (MLST).
Система серологического М-типирования основана на использовании типоспецифических анти-М-сывороток в иммунологических реакциях (например, в реакции преципитации). Для идентификации М-типа разработаны методы определения последовательности гена, кодирующего М-белок (emm-гена). Этот подход называют “золотым стандартом” молекулярного типирования стрептококков. Методика типирования включает в себя выделение ДНК исследуемого штамма, амплификацию emm-гена с помощью ПЦР и его секвенирование. В результате исследования можно идентифицировать М-типы и определить разновидности стрептококков внутри М-типов. Процедура emmтипирования позволяет выявлять циркуляцию эпидемически значимых штаммов и прогнозировать изменение эпидемической обстановки.
OF-типирование (opalescence factor – фактор опалесценции) основано на выявлении и идентификации липопротеиназы. Наличие OF-фактора определяется с помощью OF-типоспецифических сывороток. Существует множество вариантов OFфактора. По этому фактору М-типы подразделяются на OF-положительные и OFотрицательные.
Т- и tee-типирование предусматривает определение Т-типов стрептококков с помощью реакции агглютинации типоспецифическими Т-антисыворотками. Ген tee, кодирующий основную субъединицу Т-белка, идентифицируется молекулярными методами.
Мультилокусное сиквенсное типирование (MLST) основано на определении последовательности так называемых генов “домашнего хозяйства” - housekeeping genes (aroE, gdh, gki, recP, spi, xpt, ddl), отвечающих за протекание основных метаболических реакций. Эти гены характеризуются низкой частотой возникновения мутаций, поэтому позволяют устанавливать степень родства внутри всей популяции стрептококков. Сведения о последовательностях накапливаются в единых базах данных, что позволяет устанавливать эволюционные связи выделяемых культур. Наиболее широко этот прием используется при типировании пневмококков (единая база данных PMEN - Pneumococcal Molecular Epidemiology Network).