ГИСТОХИМИЯ И СВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ

Ричард В. Хоробин

1. Введение

Световая микроскопия в сочетании с гистохимическим окрашиванием позволяет решить широкий спектр биологических проблем. Гистохимические методы развивались в основном под влиянием потребностей клинической медицины — для исследований в области патологии, гематологии и других областях. Однако этими методами постоянно пользуются и биологи различных профилей, от цитогенетиков до специалистов по сравнительной зоологии. Развитие методологии всегда было обусловлено потребностями исследователей, как это можно видеть на примере недавно созданных методов гибридизации нуклеиновых кислот in situ, основанных на микроскопии. Гистохимия ориентирована в основном на биологию, однако она применяется и в пищевой промышленности, металлургии, химии полимеров и многих других областях.

Приводимые в данной главе экспериментальные методики отражают, следовательно, лишь сравнительно небольшую часть существующих методов. В предлагаемой главе можно найти полезный совет и общий обзор проблем, рассчитанный на исследователей, имеющих разную подготовку. Практические методики можно найти

вгл. 4 и 6 данной книги, а также в литературе, список которой приведен в конце главы.

1.1.Объекты для гистохимического окрашивания

1.1.1. Что такое окрашивание?

Обычно гистохимическое окрашивание производится с целью микроскопического исследования состава, строения и функций биологических объектов. Процесс окрашивания можно рассматривать как нанесение видимых меток на интересующие объекты. Для целей световой микроскопии обычно используются окрашенные метки — они могут поглощать или испускать свет. Очень часто метки имеют характерную форму.

1.1.2. Информация, получаемая с помощью окрашивания

Применение гистохимического окрашивания в сочетании с микроскопией позволяет сразу определить, чем является то, что» мы наблюдаем. Иногда гистохимическое окрашивание позволяет также получить и количественные данные.

Но ответ на вопрос «что это?» дается не обязательно в химических терминах, несмотря на название метода. С помощью гистохимического окрашивания можно, разумеется, определить разнообразные химические объекты, начиная от фрагментов молекул и кончая специфическими молекулами или классами веществ. Кроме этого, гистохимия часто применяется для идентификации биологических объектов, причем с точки зрения их биологической роли, а не химического состава. Так, важно бывает установить наличие лизосом в клетке, а особенности состава ферментов в данных органеллах могут не представлять интереса. С другой стороны, выявляемые структуры могут сами па себе не быть предметом исследования, и применение гистохимических процедур в таких случаях направлено на обнаружение различных биологических процессов. Например, они позволяют прямо наблюдать активность нейронов или определять жизнеспособность клеток. Наконец, гистохимическое окрашивание может использоваться для изучения морфологии. Примеры многочисленных типов гистохимической информации, которые можно получить, представлены в табл. 5.1.

1.2. Физико-химические основы типичных методов окрашивания

Для сознательного применения гистохимических методов необходимо иметь некоторые представления об их физико-химических основах. Поскольку в практических руководствах такие сведения обычно не приводятся, здесь будет дано общее введение в проблему. Более подробные объяснения читатель может найти в других монографиях [1, 2].

1.2.1. Внешнее разнообразие, но единство в основе

Развитие методов гистохимического окрашивания можно представить себе как ряд технических достижений, слабо подкрепленных пониманием физико-химических основ процесса. В девятнадцатом столетии использовались синтетические красители и серебрение. Потом наступил период увлечения гистохимическими окрасками с индукцией цветообразования и параллельно ему началось развитие гистохимии ферментов. Затем появились методы с использованием меченых антител, а сейчас существуют методы гибридизации in situ нуклеиновых кислот и окрашивания флуорохромами для изучения свойств живых клеток. На каждом этапе в общий арсенал гистохимии добавлялись новые методы, вспомним, например, о широко используемых методах окрашивания гематоксилином и эозином, золочении астроцитов по Рамон-и-Кахалу, реакции Фёльгена для ядерной ДНК, методах азоокрашивания для гидролитических ферментов.

96

Таблица 5.1. Примеры объектов, которые можно исследовать с помощью гистохимических методов

Многие биологи, однако, постоянно пользуются в своей работе одной или несколькими гистохимическими методиками. Вследствие этого редко кто представляет себе, насколько принципиально близки между собой разные типы гистохимических окрасок и что некоторые проблемы и трудности являются общими для разных методов. Приверженцы каждой новой волны в истории гистохимии изобретали немало велосипедов.

В гистохимии исследователь всегда имеет дело с двухфазными системами, касается ли это мазков, срезов или суспензии клеток. Импрегнация серебром или окрашивание с протравливанием— это не просто примеры окислительно-восстановительных реакций или координационных химических взаимодействий. Процедура окрашивания периодатом—основанием Шиффа не просто пример из органической химии. Гистохимия ферментов не сводится только к биохимии. Иммуноцитохимия — это больше, чем иммунология. Как и окрашивание, данные методы основаны на избирательном связывании реактивов, содержащихся в растворе, с твердой фазой препарата и избирательном выходе продуктов и/или реагентов из препарата в раствор. На практике эти связывания и потери зависят одновременно от факторов, влияющих на равновесие и на скорость.

1.2.2. Факторы, влияющие на равновесие, и эффекты сродства

Когда распределение красящего вещества между раствором и препаратом сдвинуто в сторону последнего, то говорят, что система краситель—препарат обладает большим сродством. На характер равновесного распределения влияют все компоненты системы: разумеется, большое значение имеют взаимодействия реактив—препарат, но часто существенны также взаимодействия друг с другом двух реактивов и даже растворителей. Примеры обычно встречающегося сродства будут кратко обсуждаться ниже.

I. Силы, обусловливающие взаимодействие между реактивом и препаратом. Наиболее распространенными являются короткодействующие межмолекулярные силы, такие как диполь-дипольное и дисперсионное взаимодействия; затем следуют так называемые вандерваальсовы силы. Они участвуют во взаимодействиях между всеми молекулами, но сильнее проявляются в тех случаях, когда взаимодействующие молекулы способны к поляризации или имеют большие дипольные моменты. Последним условиям удовлетворяют многие гистохимические красители, содержащие большую ароматическую часть, а также такие компоненты биополимеров, как остатки ароматических аминокислот и гетероциклические основания нуклеиновых кислот. Таким образом, изменения размеров ароматической части в молекулах красителей могут сильно влиять на окрашивание.

Многие красители и биополимеры являются ионами, поэтому важную роль в их взаимодействии играют кулоновские силы. Поскольку эти электрические силы зависят от рН или от концентрации нейтрального электролита, то, варьируя названные параметры раствора, можно регулировать окраску препаратов ионными реактивами.

Некоторые способы окраски основаны на взаимодействии красителя и препарата с образованием водородных связей. В водных растворах на это взаимодействие будет накладываться образование водородных связей с молекулами воды, так что, хотя данные связи и являются сильными, их общий вклад в' сродство красителя и препарата неясен.

В отличие от водородных связей значение наиболее сильных взаимодействий реактив—препарат, а именно ковалентных связей, очевидно. При некоторых методах окрашивания происходит образование и разрушение ковалентных связей, в результате чего компоненты препарата превращаются в окрашенные производные; в

97

других методах используется введение окрашенных меток в определенные участки молекул. Характер ковалентных связей различен. Те из них, в которых участвуют ионы металлов, являются очень полярными, и красители, действующие на основе таких взаимодействий, иногда называют в гистохимической литературе «протравой».

II. Взаимодействия краситель—краситель. Сродство препарата к красителю может возникнуть в результате такого взаимодействия, даже если при этом нет прямой реакции взаимодействия между красителем и препаратом. Ионные кристаллы сульфида свинца, откладывающиеся в местах активности ферментов, нерастворимы в воде и в спирте благодаря сильным кулоновским взаимодействиям между катионами свинца и анионами сульфида. Биологические препараты в данном случае просто выполняют роль матрикса, содержащего уже сформировавшиеся кристаллы. Другим примером такого рода является отложение металлического серебра при импрегнации. Сюда же относятся метахроматическое окрашивание и гистохимическая методика выявления ферментов с помощью азокрасителей, так как при этом для получения окраски используется взаимодействие красителя с препаратом или красителей между собой.

III. Энтропийные эффекты. Еще одним примером сродства, не связанного непосредственно со взаимодействием красителя с препаратом, является гидрофобное связывание. Этот процесс зависит от энтропии и происходит только в водных растворах. Он состоит в том, что гидрофобные молекулы реактива включаются в гидрофобные биологические структуры, что сопровождается разрывом водородных связей между молекулами реактива и воды. Поскольку гистохимическое окрашивание представляет само по себе двухфазный процесс, то распределение красящих реактивов между раствором и препаратом зависит от энтропии. Примеры красителей, действие которых основано на связях разных типов, приведены в табл. 5.2.

Из объяснения, данного выше, не следует делать вывод о том, что избирательное окрашивание происходит только за счет эффектов сродства. На практике число мест связывания красителя так же важно, как и сродство красителя к реактиву. Кроме того, окрашивание часто производят быстро, поскольку, с одной стороны, это удобно, а с другой — биологические препараты часто нестабильны. В результате равновесие при окрашивании достигается далеко не всегда, и избирательность окрашивания часто обусловлена скоростью окраски.

Таблица 5.2. Классификация гистохимических реакций по типу сродства красителя к препарату

*Описание номенклатуры красителей см. в разд. 5.4.

1.2.3.Зависимость избирательности от скорости окраски

Эффекты, обусловленные скоростью окрашивания, можно использовать для получения избирательной окраски, однако они могут проявляться и неожиданно, давая артефакты.

I. Скорость диффузии. Диффузия может ограничивать либо скорость проникновения веществ в различные компартменты неокрашенного препарата («прогрессивное окрашивание»), либо скорость выхода веществ из различных компартментов окрашенного препарата («регрессивное» или «дифференцировочное» окрашивание).

Дифференциальная проницаемость различных компартментов в биологических препаратах обусловлена многими факторами. Плотные структуры или структуры с большим содержанием поперечно сшитых либо слабо гидратированных полимеров обычно мало проницаемы, и наоборот. На скорость диффузии также влияет процесс приготовления препарата. Фиксация, вызывающая образование поперечных сшивок между белками, например фиксация глутаровым альдегидом, снижает скорость диффузии. Напротив, на некоторых стадиях процесса приготовления препарата может увеличиться степень дисперсности биологического препарата. Замораживание/высушивание, коагулирующие фиксаторы, обезвоживающие агенты, такие, как спирт, и заливка в парафин, — их применение может привести к повреждению клеток и тканей, к увеличению площади поверхности и вследствие этого к возрастанию проницаемости. Кроме того, скорость диффузии зависит от общей конфигурации препарата. Быстро окрашиваются монослои уплощенных клеток, подготовленные для цитологической или гематологической диагностики, а также тонкие срезы, полученные с твердых блоков ткани на криостате или с залитых в парафин блоков, которые красят после удаления парафина. Напротив, медленно окрашиваются срезы материала, залитого в пластик, а также толстые парафиновые или криостатные срезы,

98

изготавливаемые для нейроанатомических исследований. В табл. 5.3 приведены примеры различных методов окрашивания и влияющие на них факторы.

На скорость диффузии влияет также молекулярная структура веществ. Проще всего учесть влияние размеров: чем больше молекула, тем медленнее она диффундирует. Макромолекулярные вещества, такие как меченые антитела (гл. 4), в основном не проникают в живые клетки и в пластиковые срезы. Даже у красителей с гораздо меньшими размерами молекул обнаруживается сильно замедленная скорость диффузии, если их молекулярный или ионный вес превосходит несколько сотен дальтон. Другим существенным фактором является сродство реагента и ткани. Только вещества с низким сродством могут быстро диффундировать. Синергидного усиления избирательности окраски можно добиться, используя для окраски препарата, содержащего структуры с различной проницаемостью, два красителя с разными по размерам молекулами. Классическим примером такой системы окрашивания является трехцветный метод (окраска по Маллори), при котором высокопроницаемые коллагеновые волокна избирательно окрашиваются кислыми красителями с крупными размерами молекул, а сравнительно малопроницаемая цитоплазма клеток—кислыми красителями с малыми размерами молекул.

Все методы, основанные на различиях в диффузии, чувствительны к способу фиксации, времени и температуре окрашивания, а также к другим факторам, влияющим на диффузию.

Таблица 5.3. Влияние проницаемости препарата на зависимое от скорости окрашивание

II.Скорость реакции. При некоторых методах импрегнации препарат сначала обрабатывают солью серебра,

азатем восстановителем. Скорость восстановления должна быть не слишком велика, иначе все структуры покроются микрокристаллами серебра; но она не может быть и слишком низкой, иначе окраска вовсе не появится. Другой пример можно найти в гистохимии ферментов: выявление кислой и щелочной фосфатаз. Эти ферменты хотя и гидролизуют одни и те же субстраты, но имеют различные оптимумы рН. Продолжительная инкубация с субстратом приведет к появлению окраски в местах локализации обоих ферментов вне зависимости от рН. И наконец, последний пример — окрашивание периодатом—реактивом Шиффа. Оно включает в себя начальное окисление полисахаридов тканей, >при котором в них образуются альдегидные группы, выявляемые затем с помощью реактива Шиффа. Избирательность окрас--ки обусловлена быстротой реакции периодата с углеводами и более медленным окислением других биополимеров.

1.2.4. Катализ и другие способы воздействия на избирательность окрашивания

I.Каталитическое окрашивание. При некоторых видах окрашивания избирательность обусловлена тем, что

вопределенных участках препарата катализируются реакции, делающие эти места видимыми. Такой катализ может быть природным, а может быть индуцирован химически. Примерами первого типа являются ферменты: используя их специфические каталитические способности, можно превращать субстраты в окрашенные производные. В некоторых случаях визуализация достигается сразу, если подобраны подходящие субстраты, однако чаще для выявления фермента требуется инкубация препарата с соответствующим субстратом, а затем

— превращение бесцветного промежуточного соединения в окрашенный конечный продукт с помощью визуализирующей реакции. Примерами таких методик служит выявление дегидрогеназ цикла Кребса. Препараты тканей инкубируют с соответствующими субстратами, при этом в местах локализации дегидрогеназ образуются протоны и электроны. Они улавливаются и визуализируются в результате реакции с солями тетразолия, в ходе которой образуется нерастворимый окрашенный пигмент — формазан. В рамках описанного подхода существует множество вариантов, позволяющих выявлять широкий круг ферментов.

Иногда участки каталитической активности создаются в результате химической обработки препарата. В

99