Использование акридинового оранжевого в качестве красителя для изучения живых трипаносом уже описывалось в гл. 1.

4.2. Иммунофлуоресценция

В иммунофлуоресценции используется специфическая реакция между антителом и антигеном. Антитела, или иммуноглобулины, образуются в организме животных и человека для защиты против чужеродных тел (антигенов), таких, как бактерии, вирусы и др. Антитела, меченные флуорохромами, называются конъюгатами (табл. 4.6 в гл. 4). Когда конъюгаты используются в реакции антиген—антитело, место реакции можно видеть во флуоресцентном микроскопе вследствие отложения в нем продукта реакции. Реакция антиген—антитело очень специфш наантиген не реагирует с антителами, которые не соответствуют его структуре. Можно также метить антигены для обнаружения антител. Наиболее известными флуорохромами, использующимися для мечения, являются ФИТЦ и тетраметилродаминизотиоцианат (ТРИТЦ). Максимальное возбуждение для ФИТЦа приходится на синюю область спектра, что дает зеленую флуоресценцию (рис. 6.1). Для возбуждения ТРИТЦа используется зеленый свет, а продукт реакции дает красную флуоресценцию. Комбинации синих и зеленых возбуждающих фильтров для работы с эпиосвещением даны в табл. 6.2. Иммунофлуоресценция — это широко применяемая в настоящее время техника (гл. 4, [11, 26]). Она используется также при изучении живых клеток. Например, маркеры мембран применяются для сортировки живых клеток с помощью проточного цитофлуориметра, который позволяет осуществлять разделение (сортировку) клеток.

Иммунофлуоресценция мелких объектов, например сегментов хромосом, бывает очень слабой, и они могут быть значительно лучше видны при использовании мощного синего света лазера [15]. Недавно созданный метод визуализации слабо флуоресцирующих продуктов реакции с помощью лазерной сканирующей микроскопии описан в разд. 7.

Таблица 6.3. Прижизненное (витальное) окрашивание пресноводного планктона

1.Приготовьте суспензию живого пресноводного планктона.

2.К двум каплям ее на предметном стекле добавьте равный объем очень разбавленного водного раствора акридинового оранжевого*.

3.Накройте покровным стеклом и рассмотрите препарат.

4.Проведите поиск, лучше с помощью (разово-контрастной микроскопии, а затем установите зпиосвещение препарата сине-фиолетовым возбуждающим светом.

5.При установке желтого запирающего фильтра коловратки и другие животные дают хорошо заметную желто-зеленую флуоресценцию, благодаря чему можно проследить за их движениями. В диатомовых и других водорослях видны зеленое ядро и красные хлоролласты, можно также наблюдать, как некоторые из них скользят через поле зрения.

* Маточный раствор акридинового оранжевого может храниться неограниченно долго, если он является достаточно концентрированным, так что имеет оранжево-коричневый цвет. Четыре капли такого раствора, разведенные в 250 мл воды, дадут рабочий раствор бледно-желтого цвета.

4.3.Флуоресценция нейромедиаторов

Биогенные амины, такие, как катехоламины и 5-гидрокси-триптамин, могут быть превращены в продукты с высоким уровнем флуоресценции путем обработки высушенных тканей парами формальдегида [27]. При возбуждении фиолетовым светом (табл. 6.2) катехоламины дают бело-синюю флуоресценцию, а 5- гидрокситриптамины — желтую флуоресценцию. При использовании узкополосного возбуждения уровень аутофлуоресценции может поддерживаться на достаточно низком уровне, что позволяет получить высококонтрастное изображение [28].

4.4. Двойное окрашивание

Разработка эффективных систем фильтров для возбуждения зеленым и синим светом стимулировала использование двух флуорохромов в одном препарате. В свою очередь использование двойного окрашивания привело к разработке систем вертикальных (опак) иллюминаторов, снабженных встроенной турелью с четырьмя дихроичными зеркалами и запирающими фильтрами, а также револьвером с возбуждающими фильтрами. Для наблюдения клеток после двойного окрашивания существуют специальные иллюминаторы, позволяющие осуществлять одним движением полную смену набора фильтров, состоящего из фильтров для возбуждения, запирания и дихроичного зеркала. Примерами двойного окрашивания являются окраска эпителиальных клеток по методу акрифлавин—Фёльген—СИТЦ (АФС) [29] и мечение ФИТЦ- и ТРИТЦконъюгатами в одном препарате.

123