4.6.1. Применение пцр в клинической практике

Наиболее широко молекулярно-биологические методы используются в микробиологии, вирусологии и в онкологии.

В микробиологии и вирусологии этим методом определяют клинически важные виды бактерий, грибов, вирусов, а также оценивают их вирулентность и устойчивость штаммов к лекарствам. Применение ПЦР как метода микробиологической диагностики имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными методами:

• Прямое определение наличия возбудителей

• Высокая чувствительность

Чувствительность ПЦР тест-систем составляет 10–1000 клеток возбудителя в анализируемой пробе, в то время как чувствительность иммунологических, паразитологических тестов колеблется в пределах 10³–10⁵ клеток.

Следует, однако, отметить, что высокая чувствительность ПЦР создает и определенные клинические проблемы. В частности, встает вопрос о клиническом значении выявляемых ПЦР чрезвычайно низких количеств патогена. Кроме того, метод ПЦР сложно использовать для мониторирования эффективности терапии, в связи с тем, что метод детектирует как живые, так и погибшие микроорганизмы.

• Высокая специфичность

Высокая специфичность метода обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного вида фрагмент ДНК либо РНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью специфических праймеров и специально отрабатываемыми жесткими условиями их присоединения или «отжига» к искомой молекуле ДНК.

• Простота исполнения, возможность полной автоматизации и быстрота получения результатов

• Использование для анализа непосредственно клинического и патологического материала

Метод ПЦР позволяет проводить определение возбудителя заболеваний непосредственно в клиническом материале (кровь, мазки, смывы, соскобы, слюна, мокрота, спинномозговая жидкость, желудочный сок, биоптаты и т.д.). Для проведения анализа не требуется выделения и выращивания культуры возбудителя.

• Малое количество используемого материала для исследований

Количество исследуемого материала может составлять несколько десятков микролитров, так как в результате проведения ПЦР концентрация анализируемого участка ДНК (РНК) выявляемого возбудителя увеличивается в сотни и тысячи раз.

• Возможность выявления некультивируемых, труднокультивируемых или персистирующих форм патогенных организмов

Особенно это важно при обследовании серонегативных пациентов на самых ранних стадиях развития патологического процесса, когда лечение наиболее эффективно. При диагностике с помощью ПЦР достигается размножение не тестируемого организма, а только специфического фрагмента его ДНК, являющегося маркерным для данного вида.

• Исключение возможности инфицирования персонала в процессе проведения ПЦР

Исследуемый материал может быть дезинфицирован химической или термической обработкой в момент его взятия, следовательно, исключается возможность инфицирования персонала в процессе проведения ПЦР.

В онкологии метод используется для поиска клинически значимых маркеров злокачественности и определения их количества у пациентов, для определения микрометастазов и минимальной остаточной болезни, а также для контроля за результатами терапии. Метод хорошо зарекомендовал себя как очень чувствительный (~1 раковая клетка на 10⁶ нормальных клеток) и высокоточный метод для детекции раковых клеток в жидкостях организма.

В акушерстве перспективно использование ПЦР в предимплантационной и пренатальной диагностике, скрининге новорожденных. В терапевтической практике – для оценки генетической предрасположенности к различным заболеваниям, генотипирования ферментов метаболизма лекарственных средств и выявления степени чувствительности или резистентности к определенным препаратам.