2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Бактериальный_вагиноз_Василенко_Л_В_

часто остаются и приобретают характер самостоятельного заболевания (Ворона И. Г. и

соавт., 1990).

Гормональные факторы играют роль в патогенезе БВ, потому что эти нарушения

встречаются только у женщин преимущественно репродуктивного возраста.

Убольных БВ уровень лактогена (ЛГ) в плазме крови по сравнению с контролем не имеет существенных различий в фолликулярной и лютеиновой фазах цикла (Кира Е. Ф., 2001). Уровень ФСГ в репродуктивном возрасте находится в пределах нормальных величин по сравнению с контролем, но достоверно ниже (р <0,05). У больных БВ колебания концентрации ФСГ в фолликулярной и лютеиновой фазах цикла имеют место и бывают или низкими, или высокими, чего не наблюдается в контроле (Кира Е. Ф., 2001).

Концентрация эстрадиола при БВ достоверно выше по сравнению с контролем и не меняется со сменой фаз менструального цикла. Следовательно, у больных БВ нарушение эстрогенной функции яичников проявляется в умеренно выраженной гиперсекреции эстрадиола на фоне сохраненной секреции суммарных эстрогенов.

Убеременных часто развиваются вагиниты при миоме матки, которая как правило, сопровождается гиперэстрогенией (Медведева Е. А., 1984).

При БВ в фолликулярной и лютеиновой фазах менструального цикла средние величины концентрации прогестерона были всегда выше, чем в контроле. Это свидетельствует о гиперсекреции прогестерона при БВ на протяжении всего менструального цикла, способствующей ускорению процессов пролиферации клеток эпителия влагалища, снижению в них гликогена, образованию "ключевых клеток". Таким образом, нормальный уровень суммарных эстрогенов, увеличение секреции эстрадиола, прогестерона на протяжении всего менструального цикла приводит к нарушениям в микроэкологической системе влагалища. Возможно, высокая концентрация прогестерона приводит к увеличению IgA в сыворотке крови. Роль прогестерона и его соотношения с эстрогенами имеют важное биологическое значение

вподдержании оптимального физиологического статуса влагалища, а также в развитии БВ.

Уровни пролактина, тестостерона, кортизола, Т3 и Т4 у больных БВ и здоровых женщин не имеют существенных различий, поэтому их патогенетическая роль в развитии дисбиотических состояний влагалища не установлена.

Гормональные изменения у больных БВ пропорциональны длительности заболевания. Таким образом, на основании синхронного определения в крови ФСГ, ЛГ,

23

эстрадиола и прогестерона можно констатировать, что на фоне повышенной секреции прогестерона, эстрадиола, сохраненной секреции суммарных эстрогенов и сниженной секреции ФСГ у больных БВ имеется различная динамика уровней ЛГ. Эти изменения можно расценивать как свидетельство первичности нарушений стероидогенеза в яичниках, играющих важную роль в патогенезе БВ (Кира Е. Ф., 2001).

Гистологические исследования влагалищной стенки у больных БВ свидетельствуют о том, что для БВ не характерна воспалительная реакция. Следовательно, БВ является не воспалительным заболеванием, а дисбактериозом.

Большую роль в патогенезе БВ играет местный иммунитет, который обеспечивает поддержание постоянства среды во влагалище. Местная защита половой сферы обусловлена ее анатомическими и физиологическими особенностями, наличием нормальной микрофлоры, присутствием лизоцима, комплемента, трансферрина, иммуноглобулинов и связанных с ними антител.

Неспецифические факторы местной защиты влагалища многообразны и представляют собой единую систему, включающую в себя как комплекс химических элементов (цинк, медь, железо и др.), веществ органической природы (лизоцим, трансферрин, гликопротеины и др.), так и каскад осуществляемых ими реакций.

Первым барьером на пути внедрения возбудителей и распространения инфекции становится влагалище. Слизистая оболочка вагины покрыта многослойным плоским неороговевающим эпителием, который изменяется под влиянием эстрогенов и гестагенов.

Кнеспецифическим механизмам защиты относят состояние микробиоценоза влагалища и присутствие лизоцима. Они определяют уровень и качество сопротивления патологическому воздействию.

Кглавным клеточным механизмам резистентности относятся моноцитарномакрофагальное звено и фагоцитоз, к гуморальным – факторы системы комплемента.

При БВ не наблюдается высокого числа лейкоцитов. Оценивать лейкоцитоз во влагалище следует не по количеству клеток, а по их функциональной активности. При БВ во влагалище часто обнаруживаются «мертвые» функционально неактивные клетки. Фагоцитоз нарушен и проявляется в виде незавершенности или отсутствия лизиса микробных тел.

Происходит снижение концентрации IgA, ответственного за противомикробную

ипротивовирусную защиту. Это объясняется тем, что при БВ нет патогенных бактерий, а индигенные анаэробные микроорганизмы не обладают выраженными антигенными

24

свойствами, способными индуцировать повышенную активность образования антител. Во влагалище у больных БВ по сравнению со здоровыми женщинами достоверно (р<0,01) снижено количество иммунных комплексов (Кира Е. Ф., 2001).

При БВ происходят глубокие изменения, затрагивающие все уровни микроэкосистемы влагалища. Наблюдаются процессы дезинтеграции клеточных слоев

ицитолиза. В биохимическом составе ВЖ происходят достоверные изменения, отражающие нарушения практически всех ключевых показателей основных видов обмена веществ: белкового, углеводного, липидного, водно-электролитного и минерального.

Одним из пусковых механизмов развития БВ является смещение рН ВЖ в щелочную сторону. Изменение кислотности создает неблагоприятные условия для жизнедеятельности нормальной микрофлоры влагалища – лактобактерий, способствует размножению полиморфного микробного сообщества – мобилюнкус, бактероидов, пептококков, пептострептококков, вейллонелл и др. рН ВЖ, с одной стороны, поддерживается продукцией молочной кислоты молочнокислыми бактериями, а с другой – регулируется процессами ацидоаммониогенеза в эпителии влагалища. Эпителию влагалища свойственна регуляторная функция в поддержании оптимума водородных ионов.

Возможно, что образующаяся в результате гомоферментного брожения глюкозы молочная кислота количественно не может обеспечить поддержание рН ВЖ в константных пределах. Очевидно, что изменение рН является не следствием БВ, а его причиной. Это связано и с нарушениями регуляторной функции эпителия влагалища, обусловленными процессами цитолиза и дезинтеграции клеток, что может объясняться различными причинами: хронической урогенитальной инфекцией, изменениями гормонального статуса, кислотно-основного состояния, соматическими заболеваниями, нерациональной антибиотикотерапией, неблагоприятными факторами внешней среды, внутриклеточным паразитизмом и др.

Повышение концентрации ионов Na+ и Cl- также свидетельствует о нарушении реабсорбции влагалищного эпителия. Повышение концентрации ионов Na+ может быть

икомпенсаторным механизмом, так как при БВ наблюдается снижение концентрации осмотически активных веществ, таких как глюкоза и мочевина. Компенсаторное повышение концентрации ионов Na+ приводит к повышению гидратации, проявлением чего следует считать наличие обильных жидких выделений – наиболее типичного клинического признака БВ.

25

Увеличение рН ВЖ приводит к повышению активности протеолитических ферментов, таких как пролинаминопептидаза, сиалаза, муциназа. Это приводит к гидролитическому расщеплению белковых макромолекул, в том числе и коллагена, что способствует дезинтеграции клеток эпителия, нарушению их функции и повышению концентрации свободных жизнеспособных клеток во ВЖ. Эти клетки становятся субстратом для обеспечения жизнедеятельности анаэробных, ассоциированных с БВ, микроорганизмов.

Активация ферментов сиалазы и муциназы провоцирует к нарушению слизеобразования, что облегчает доступность для микроорганизмов клеток эпителия. Повышение адгезивной способности этих микроорганизмов происходит за счет модификации клеточных рецепторов микробными протеазами, повышения рН ВЖ и снижения red-ox-потенциала эпителия влагалища.

При БВ во ВЖ обнаружена более высокая, чем у здоровых женщин, активность внутриклеточных ферментов АЛТ, АСТ и щелочной фосфатазы. Это свидетельствует об активации цитолитических процессов.

Повышается уровень показателей перекисного окисления липидов (ПОЛ). Это может свидетельствовать об ускорении процессов пролиферации клеток эпителия влагалища. Цитолитические процессы при этом скорее связаны с воздействием на клетки микробных цитолизинов.

В обеспечении метаболизма анаэробов большое значение имеют декарбоксилазы. Их действие направлено на декарбоксилирование аминокислот. В результате этого образуются биогенные амины и СО2. Последний создает бескислородные условия среды, необходимые для размножения и жизнедеятельности анаэробной микрофлоры.

Клинически БВ проявляется запахом «гнилой рыбы». При этом аминовый тест положительный. Это обусловлено присутствием летучих аминов, таких как метиламин, диметиламин, триметиламин, кадаверин, путресцин.

Дефицит соединительнотканной основы приводит к нарушению сцепления клеток эпителия и более высокой их десквамации, повышению их содержания во влагалищной жидкости. Жизнеспособные эпителиальные клетки создают анаэробам условия для их метаболизма. В этих клетках не накапливается гликоген, что приводит к уменьшению титра лактобактерий. Снижение титра лактофлоры вызывает нарушение процессов образования перекиси водорода и молочной кислоты. Бактерицидность ВЖ снижается.

26

Глюкоза ВЖ под действием ферментов бактерий превращается в молочную кислоту, которая под влиянием лактатдегидрогеназы превращается в пируват.

Анаэробная флора утилизирует глюкозу в ферродоксиредуктазной реакции в пируват с образованием ацетил-СоА. Последний используется для синтеза жирных кислот с короткой углеродной цепью (С3-С6) – маркерных метаболитов БВ.

В результате этого процесса истощаются запасы глюкозы и гликогена в эпителиальных клетках. Происходит нарушение метаболической основы для нормальной ацидофильной микрофлоры.

Патогенез БВ определяется нарушениями баланса между функциональной активностью эпителия влагалища, соотношением ацидофильности другой индигенной микрофлоры и их метаболическими процессами, что свидетельствует о дисбиотической природе БВ.

При БВ запускается простагландиновый механизм. Бактерии, главным образом анаэробы, продуцируют фосфолипазу А2, которая стимулирует продукцию ПГF2

(Takahashi K. et al., 1988).

Глава 5. Клиника и диагностика бактериального

вагиноза

Инкубационный период при БВ составляет 10 дней. В клинике доминируют жалобы на выделения с неприятным запахом, чаще умеренные, реже – обильные, а в ряде случаев - даже отсутствуют (Spiegel C. A. et al., 1980). Выделения имеют серобелый цвет, гомогенны, без комков, имеют «рыбный запах». Этот запах может быть постоянным, отсутствовать, появляться во время месячных и полового акта. Эти симптомы существуют длительно. При длительном течении заболевания выделения приобретают желтовато-зеленую окраску, становятся густыми, напоминают творожистую массу, обладают свойством пениться, становятся тягучими и липкими, равномерно распределяются по стенке влагалища.

Редко встречаются жалобы на зуд и дизурические расстройства или они могут появляться периодически. Частота этих симптомов составляет 15,9 – 22,9% (Анкирская А. Е., 1996; Galask R. P. et al., 1976; Vegtorp M. et al., 1988).

27

Иногда женщины с БВ жалуются на обильные месячные, боли внизу живота (Кубанова А. А. и соавт., 1996). В ряде случаев ни субъективных жалоб, ни объективных симптомов нет (Thomason J. L. et al., 1984). Зуд вульвы и влагалища наблюдается редко.

Предварительный диагноз БВ может быть поставлен при гинекологическом осмотре. При осмотре наружных половых органов выявляют отечность слизистой вульвы, парауретральных ходов, уретры и выводных протоков больших желез преддверия влагалища. Стенки влагалища умеренно отечны. Часто выявляются эрозии шейки матки, имеющие вид ярко-красной зернистости вокруг цервикального канала с четкими границами. При расширенной кольпоскопии обычно выявляется эктопия цилиндрического эпителия, которая чаще имеет сочетанный генез – дисгормональный и воспалительный, ибо БВ часто сочетается с бактериальными вагинитами, цервицитами. Выделения водянистые со специфическим запахом.

Для диагностики БВ не нужно брать мазки из цервикального канала и уретры, ибо их микрофлора не идентична и не характеризует БВ, хотя и несет информацию о наличии воспалительного процесса, который часто имеет место и носит вторичный характер, обусловленный БВ. Материал лучше забирать ложечкой Фолькмана и помещать в пробирку с универсальной транспортной средой (Stuart transport medium; BioMerioux, Becton Dickinson).

Для определения рН вагинального содержимого материал берут стерильным ватным тампоном и наносят на бумагу. Этим же тампоном наносят два мазка на предметные стекла. С одним мазком проводят темнопольную микроскопию. Другой мазок окрашивают по Грамму и осуществляют световую микроскопию.

При помощи темнопольной микроскопии материал изучают на присутствие T. vaginalis, Mobiluncus spp., нитей мицелия или дрожжеподобных грибов. На оставшиеся выделения на тампоне наносят несколько капель 10%-ного КОН – так проводится аминовый тест. Нередко даже без проведения этого теста при вагинальном осмотре улавливается запах «гнилой рыбы».

Диагноз БВ устанавливается при трех признаках из четырех приведенных ниже: -характерные выделения; -рН больше 4,5; -положительный аминотест;

-наличие «ключевых» клеток в мазке.

28

Ключевые клетки представляют собой отторгшиеся клетки влагалищного эпителия с адсорбированными на их поверхности микроорганизмами.

В норме рН влагалищного отделяемого составляет 3,8-4,5. При БВ рН превышает 4,5. Определение рН производится с использованием индикаторной бумаги с эталонной шкалой, лакмусовой бумажки или рН-метром. Ошибки при определении РН влагалищной жидкости могут быть во время месячных, после coitus, так как сперма имеет щелочную реакцию. Антибактериальные и гормональные препараты также изменяют рН влагалищной жидкости.

Аминотест обусловлен выработкой диаминов путресцина и кадаверина. Анаэробные микроорганизмы подвергают аминокислоты декарбоксилированию. Соли этих соединений превращаются в летучие амины в щелочной среде. Появляется запах “гнилой рыбы”. G. vaginalis не продуцирует летучие амины, поэтому при доминировании G. vaginalis при БВ аминовый тест может быть отрицательным. Чувствительность и специфичность этого теста равны 79 и 97% (Муравьева В. В., 1997).

Различают несколько видов биоценоза влагалища. Нормоценоз характерен доминированием лактобактерий, отсутствием грамотрицательной микрофлоры, спор, мицелия, псевдогифов, наличием единичных лейкоцитов, единичных «чистых» эпителиальных клеток соответствующих фазе менструального цикла.

Промежуточный тип характеризуется умеренным количеством лактобактерий, наличием грамположительных кокков, грамотрицательных палочек. Обнаруживаются лейкоциты, моноциты, макрофаги, эпителиальные клетки. Часто наблюдается у здоровых женщин, редко сопровождается субъективными жалобами и клиническими проявлениями.

Для дисбиоза влагалища характерны незначительное количество или полное отсутствие лактобактерий, обильная полиморфная грамотрицательная и грамположительная палочковая и кокковая микрофлора, наличие «ключевых» клеток. При этом количество лейкоцитов вариабельно, незавершенный фагоцитоз отсутствует или он есть. Картина мазка полимикробная.

Бактериальный вагиноз различают по степеням тяжести (Мавзютов Р. А. и соавт., 1995):

1-я степень - компенсированный БВ. Для него характерно полное отсутствие в исследуемом материале микрофлоры при неизмененных эпителиоцитах. Такое состояние не рассматривается как патологическое, но отсутствие лактобактериальной

29

флоры свидетельствует о возможности заселения пустой экологической ниши попадающими с наружных половых органов микроорганизмов и последующим формированием БВ. Такое состояние может наблюдаться после проведения антибактериальной терапии антибиотиками широкого спектра действия.

2-я степень – субкомпенсированный БВ. Он характеризуется количественным снижением лактобактерий, увеличением числа грамвариабельной полиморфной бактериальной флоры, появлением в поле зрения единичных «ключевых» клеток при небольшом лейкоцитозе (15-25 в поле зрения). «Ключевые» клетки представлены как покрытыми бактериальной флорой снаружи эпителиоцитами, так и содержащими бактерии внутриклеточно ввиду неспецифического осуществления эпителиальными клетками функций фагоцитоза.

3-я степень – декомпенсированный БВ. Он характеризуется выраженной клинической симптоматикой; микроскопически наблюдается полное отсутствие лактобактерий; все поле зрения покрыто «ключевыми» клетками. Бактериальная флора представлена различными микроорганизмами, как в монокультуре, так и в различных морфо- и видовых сочетаниях (Мавзютов А. Р. и соавт., 1995).

Бактериологическое исследование позволяет оценить качественные и количественные характеристики микрофлоры влагалища. Усовершенствование бактериологического метода диагностики изменило имевшиеся ранее представления о критериях нормы. Установлено, что наряду с лактобактериями в составе нормальной микрофлоры имеются условнопатогенные микроорганизмы (стафилококки, стрептококки, некоторые грамотрицательные бактерии) (Ленцнер А. А. и соавт., 1988; Летучих А. А., 1995). По мере совершенствования культивирования анаэробной флоры расширился спектр микроорганизмов, входящих в состав нормальной вагинальной микрофлоры (Мартикайнен З. Н., 1995; Муравьева В. В., 1997).

При бактериологическом исследовании нормоценоз характеризуется тем, что общее количество микроорганизмов в вагинальном отделяемом составляет 106-108

КОЕ/мл, абсолютно преобладают лактобактерии, условно-патогенные микроорганизмы выделяются в титре менее 104 КОЕ/мл.

Бактериальный вагиноз при бактериологическом исследовании характеризуется массивным микробным обсеменением вагинального отделяемого с общим количеством микроорганизмов, превышающим 109 КОЕ/мл. Лактобактерии отсутствуют или их титр снижается до 104 КОЕ/мл и менее. Наблюдается выраженный полимикробный

30

характер микрофлоры с абсолютным преобладанием облигатно-анаэробных микроорганизмов и G. vaginalis (Муравьева В. В., 1997).

При проведении классического бактериологического исследования необходимо учитывать тот факт, что само по себе обнаружение отдельных видов облигатных анаэробов и G. vaginalis не всегда равнозначно микробиологическому диагнозу БВ, так как G. vaginalis и облигатно-анаэробные микроорганизмы могут быть частью индигенной микрофлоры, поэтому, бактериологическая диагностика БВ должна, в первую очередь, основываться на интегральной оценке микрофлоры с учетом не только ее видового и количественного составов, но и количественного соотношения отдельных ее компонентов.

В значительной мере проблему обнаружения анаэробной микрофлоры в лабораторных условиях решает световая микроскопия с окраской мазков по Грамму. При этом легко обнаруживаются микроорганизмы, имеющие характерную форму и локализацию. В мазке видны «ключевые» клетки, которые представляют собой зрелые эпителиальные клетки, по поверхности которых плотно и в большом количестве прикреплены мелкие грамвариабельные палочки - G. vaginalis. Одновременно в таком мазке обнаруживаются представители семейства Mobiluncus, имеющих характерную форму. При окраске по Грамму они вариабельны или грамотрицательные, несмотря на строение клеточной стенки, характерной для грамположительных бактерий. Это связано с очень тонким пептидогликановым слоем, что снижает эффективность прокрашивания. Существенным недостатком микроскопического анализа мазка является невозможность видовой идентификации микроорганизмов. Качественная оценка микрофлоры заключается в характеристике только морфотипов бактерий: лактоморфотип, морфотипы гарднереллы, бактероидов, фузобактерий, мобилункуса, вейллонеллы.

Решить проблему быстрого и качественного обнаружения представителей анаэробной микрофлоры и микроаэрофилов могут методы генодиагностики (ДНКгибридизация и ПЦР), которые позволяют выявлять микроорганизмы непосредственно в мазке, минуя стадию культивирования и выделения чистой культуры. Методы генодиагностики основаны на детекции ДНК возбудителя в клиническом материале. Сходство физико-химических свойств всех нуклеиновых кислот позволило создать универсальные процедуры обнаружения ДНК любых микроорганизмов в биопробе, а уникальность генетического материала каждого конкретного возбудителя легла в основу специфичности метода, позволяющего

31

проводить видовую идентификацию. Для проведения генодиагностики не требуется забора образцов в специальные транспортные среды и создания особых условий хранения и транспортировки. При этом время проведения анализа сопоставимо по скорости с микроскопическим исследованием и составляет 4-5 часов.

Основным методом генодиагностики, используемым при обследовании больных с БВ, является полимеразная цепная реакция (ПЦР). В основе метода ПЦР лежит комплементарное достраивание участка геномной ДНК или РНК возбудителя, осуществляемое in vitro с помощью фермента термостабильной ДНК-полимеразы. Специфичность метода определяется уникальностью генетического материала выявляемых инфекционных агентов, к которому подобраны олигонуклеотидные праймеры, участвующие в процессе амплификации.

ПЦР-анализ клинического образца включает в себя три основных этапа: пробоподготовка, амплификация и регистрация анализов. Забор материала для проведения ПЦР диагностики не требует специальных транспортных сред. Объектом исследования могут быть соскоб клеток цервикального канала, уретры, отделяемое влагалища. Взятый материал на холоде доставляют в ПЦР лабораторию. Из полученного биоматериала легко выделяют нуклеиновые кислоты ДНК и РНК, являющиеся матрицей в реакции амплификации.

Реакция амплификации представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза специфической области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНКзависимой ДНК-полимеразы. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 30-40 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой специфических праймеров, в количестве, достаточным для его детекции. Детекция продуктов амплификации осуществляется с помощью электрофореза в агарозном геле (большинство отечественных тест-систем) либо путем гибридизации со специфическим к последовательности ампликона олигонуклеотидным зондом (диагностические системы фирмы Roche, наборы серии ПлаТАн НПФ «Литех»).

Отличительной особенностью ПЦР диагностики является универсальность подхода для выявления различных инфекционных агентов. Так как объектом исследования служит молекула ДНК, обладающая сходными химическими свойствами у всех организмов, процедуры выявления вирусной, бактериальной, человеческой ДНК одинаковы, что позволяет проводить комплексное исследование биопробы методом ПЦР.

32