2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Инфекции_в_акушерстве_и_гинекологии_Чайка_В_К_

циальныи риск реализации инфекционного процесса у ребенка в постнатальном периоде.

Термины «инфицирование» и «внутриутробное инфицирование» не являются отражением нозологических единиц патологии и поэтому не должны использоваться в качестве диагноза.

Под внутриутробной инфекцией следует понимать установленный факт внутриутробного проникновения к плоду микроорганизмов, при котором в организме плода и новорожденного произошли характерные для инфекционной болезни патофизиологические изменения, выявляемые пренатально или вскоре после рождения. Термин «внутриутробная инфекция» при использовании в клинической практике в качестве диагноза должен быть конкретизирован не только по этиологии, но и по эпидемиологическим позициям — когда и в каких условиях произошло инфицирование (в антенатальный или интранатальный период). Для этого может быть использован термин «врожденная инфекция». Данный термин может применяться в тех случаях, когда инфицирование

41

---------------------------------- Глава 2 -----------------------------------

плода произошло внутриматочно (т.е. антенатально) и к моменту рождения ребенка имеются клинические проявления.

Выводы

Для установления возможного инфицирования плода/новорожденного вследствие материнской инфекции важны следующие моменты:

—распространенность инфекции;

—частота инфекции во время беременности;

—риск трансмиссии от матери плоду;

—период трансмиссии от матери плоду;

—факторы риска материнской и перинатальной инфекции;

—ранние и поздние последствия врожденной/перинатальной инфекции.

ЛИТЕРАТУРА

Врожденные, перинатальные и неонатальные инфекции / Под ред. А. Гриноу, Дж. Осборна, ILL Сазерленд. — М.: Медицина, 2000. — 288 с.

Глуховец Б.И., Глуховец Н.Г. Патогенетические основы внутриутробной инфекциий // Архив патологии. — 1997. — № 5. — С. 74-77.

Дрть Т.М. До питания профилактики та лшування хорюамнюшту та внутршньоутробного шфшування плода // Пед1атр1я, акушерство та гшеколопя. — 1999. — № 4. — С. 232-235.

Лаврова Д.В., Михайлова А.В., Гасанова Т.В. Инфекции в акушерстве, гинекологии и перинатологии. — Саратов, 1996. — С. 60-61.

Протоколы диагностики и профилактики внутриутробных инфекций у новорожденных детей. — 2-е изд. — М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2002.

Тютюник В.Л., Зайдиева З.С., Бурлев ВА. Особенности течения беременности и исход родов при хронической плацентарной недостаточности и инфекции // Проблемы репродукции. — 2000. — Вып. 6, № 5. — С. 5660.

Congenital and Perinatal Infections: Prevention, Diagnosis and Treatment / Mari-Louise Newell — Cambridge University Press, 2000. — 343 p.

Infectious Diseases in Obstetrics and Gynecology / Gilles R.G. Monif David A. Baker. — 2004. — 760 p.

Obstetric and Gynecologic Infectious Disease / Joseph G. Pastorek. — New York: Raven Press,1993. — 798 p.

42

---------------------------------- Глава 3 --------------------------------------

ражении культуры клеток L-929, Mc Coy или эпителиальных клеток оболочек желточных мешков 6-8-дневных куриных эмбрионов и выделении возбудителя с использованием моноклональных антител. Преимуществом метода является высокая специфичность и чувствительность. Метод не дает ложноположительных результатов. К недостаткам относят его трудоемкость и дороговизну, что ограничивает его применение в повседневной практике. Как правило, этот метод используется в научных целях.

Цитологический метод

Основан на микроскопическом исследовании мазка после окраски красителями. Чувствительность данного метода составляет 10-40%.

Это наиболее доступный и технически простой метод. Но его диагностическая ценность снижается из-за субъективной оценки результата.

Посев на специфическую среду

С целью выявления возбудителей можно использовать различные посевы на специальные среды. Таким способом выделяют бактерии, грибы, микоплазму, уреаплазму. Метод позволяет определить концентрацию микроорганизма в полученной среде, что во многих случаях является очень важным. Диагностически значимое количество микроорганизмов, выявляемых этой методикой, соответствует 104 КОЕ /мл и более.

Молекулярно-биологические методы

Не так давно были разработаны молекулярно-биологические методы, основанные на анализе нуклеотидной последовательности, которые способны повысить титры чувствительности до 1:10 микроорганизмов. К ним относятся: метод ДНК-зондов, лигазная цепная реакция, полимеразная цепная реакция.

Метод ДНК-зондов. Метод точечной гибридизации нуклеиновых кислот на твердой фазе с использованием ДНК-зонда, меченного биотином. Тесты, основанные на этой методике, имеют множество преимуществ с точки зрения транспортировки, обработки и скорости исследования. Чувствительность метода — 78-90%, специфичность — 98%. Материалом для исследования является любая биологическая среда организма.

44

Лигазная цепная реакция. Основана на зависимой от мишени амплификации с использованием термостабильной ДНК-лигазы.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР была открыта в 1986 году американским биохимиком Кэри Мюллисом. ПЦР позволяет выявить в исследуемом материале наличие специфического участка ДНК, характерного для исследуемого организма, и многократно размножить его. В основе метода лежит многократное увеличение числа копий специфического участка ДНК (так называемая направленная амплификация ДНК). Специфичность метода составляет 100%, преимуществом является также быстрота получения результатов.

Серологические реакции

Принцип этих реакций основан на выявлении антигенов с помощью специфических антител — либо поликлональных, полученных при иммунизации животных антигенами, либо моно-клональных, полученных с помощью гибридомной технологии. В основе этих методов лежит реакция специфического связывания антиген-антитело. Различия методов заключаются в способах регистрации и учета этой реакции. К основным серологическим реакциям относятся:

—реакция связывания комплемента (РСК);

—реакция нейтрализации (РН);

—реакция непрямой геммаглютинации (РНГА);.

—реакция иммунофлюоресценции (РИФ);

—радиоиммунный анализ (РИА);

—иммуноферментный анализ (ELISA, ИФА).

В настоящее время классические серологические реакции типа РСК, РН, РПГА в силу их низкой чувствительности, высокой трудоемкости, малой пригодности к автоматизации отступили на второй план. Все большее распространение получили РИФ и ИФА.

Метод иммунофлюоресценции. Как в прямой, так и в непрямой модификации позволяет выявить возбудителя по содержанию в них антигена с помощью моноклональных антител. Метод быстрый, простой и недорогой, но оценка результата является субъективной и требует высокого уровня подготовки. Недостаточная чувствительность отмечена у больных с вялотекущей и асимптома-тической инфекцией.

Иммуноферментный метод. Полученный материал обрабатывается специальной тест-системой. Метод основан на определении антигена с помощью моноклональных антител.

45

---------------------------------- Глава 3 --------------------------------------

На положительный результат в этих случаях указывает изменение окраски пробы, которое измеряется спектрофотометрпческим способом. Данный метод позволяет одновременно проводить исследование большого количества проб и объективно оценивать результаты.

Однако в течение 1-1,5 месяца после излечения происходит слущивание разрушенных клеток, содержащих поверхностный антиген, с которым реагируют моноклональные антитела. Поэтому в течение этого времени контрольный анализ может быть положительным.

Выделение вирусов

Количество вируса в организме обычно бывает максимальным в первые несколько дней после заражения. К моменту появления первых симптомов у больного нередко бывает уже слишком поздно выделять вирус, вызвавший заражение. У некоторых людей, однако, может наблюдаться длительное выделение вируса. Поэтому целесообразно пытаться выделять его у больных с подозрением на вирусную этиологию заболевания. Однако если вирус не найден, то это не исключает вероятности вирусной инфекции.

Выделение вируса у новорожденных с подозрением на врожденную инфекцию следует проводить как можно быстрее после рождения, чтобы не спутать случаи с неонатальной инфекцией или инфекцией более позднего детского возраста.

Для правильной диагностики инфекционного процесса очень важно производить правильный забор материала. При подозрении на вирусную инфекцию пораженные органы не всегда являются теми участками организма, в которых легче всего выделить вирус. Мазки из носа и мокрота обычно непригодны для выделения вируса. Моча также в ограниченной степени пригодна для этих целей, однако она является предпочительной пробой при исследовании на цитомегаловирусную инфекцию (ЦМВ). При вирусных заболеваниях, вызывающих образование везикулярной сыпи, для выделения вируса необходимо брать мазок содержимого везикул.

Выделение бактерий

Для того, чтобы максимально увеличить вероятность выделения бактерий, необходимо отбирать материал для исследования до начала антибиотикотерапии. Материалом для бактериологического исследования являются глоточные мазки, мазки из половых ор-

46

---------------------------------- Глава 3 ------------------------------------------------

ганов, гемокультура. Необходимо отметить, что при заборе материала нужно учитывать, что некоторые возбудители являются внутриклеточными паразитами (Chlamydia). Поэтому важно, чтобы были отобраны клетки, наиболее вероятно содержащие данные микроорганизмы.

Обнаружение специфических антител

По свойствам антител различают два понятия: аффинность (или аффинитет) и авидность (или авидитет).

Аффинность — это степень специфического сродства активного центра к антигенной детерминанте; авидность — это степень прочности связывания молекулы антитела с молекулой антигена. Чем выше аффинность (степень сродства), тем выраженнее и авидитет (прочность связывания). Кроме того, авидитет тем сильнее, чем больше связывающихся центров.

Антитела, реагирующие на инфекцию, впервые появляются примерно через неделю после заражения. Вначале вырабатываются антитела класса IgM, затем начинают вырабатываться антитела класса IgG. После появления антител класса IgG начинается снижение титров IgM-антител. Через некоторый промежуток времени, длительность которого зависит от особенностей возбудителя и организма больного, антитела IgM уже не определяются. Нарастание уровня IgG происходит в течение нескольких недель. IgG обладают наиболее высокими аффинностью и авидностью. В начале иммунного ответа образуются низкоаффинные антитела. Позже в процессе вырабатывания иммунного ответа в организме появляются высокоаффинные IgG-антитела. Высокоаффинные IgG-антитела остаются в организме в течение длительного времени.

В случаях, когда IgM обнаруживаются в крови, необходимо разделять первичную инфекцию и обострение. Для этого рекомендуется определять авидность антител IgG. Если в крови при наличии IgM обнаруживаются IgG с низкой авидностью, то это свидетельствует о первичной инфекции. Наличие же высоко авидных антител IgG (в присутствии IgM) говорит о вторичном иммунном ответе в случае попадания возбудителя в организм или обострения (реактивации) инфекции.

У новорожденных выявление IgM-антител имеет диагностическое значение, так как материнские IgM, в отличие от IgG, не проникают через плаценту. Появление IgM у новорожденных наблюдается только при их инфицировании, в то время как обнаружение IgG может быть следствием пассивного переноса от матери.

47

---------------------------------- Глава 3 ------------------------------------

Материнские антитела могут персистировать у ребенка до одного года. Поэтому целесообразно одновременно исследовать сыворотку матери и младенца, что позволяет исключить пассивный перенос антител.

Антитела определяют с помощью серологических реакций, принцип которых заключается в выявлении антител с помощью специфического антигена. Реакция основана на специфическом связывании антиген—антитело.

Для выявления антител используют классические серологические способы (РСК, РПГА, РН, РИФ), а также ИФА, чувствительность которого на 2-4 порядка выше по сравнению с классическими серологическими методами.

Важными понятиями в серодиагностике являются: сероконвер-сия антител, титр антител, серая зона.

Сероконверсия — появление специфических антител в сыворотке крови или увеличение их титра в 2-4 раза.

Титр антител — способ полуколичественного выражения содержания специфических антител в сыворотке крови. Титр выражается в виде дроби, представляющей собой степень разведения исследуемой сыворотки, при котором анализ дает результат (1:100; 1:200 1:400 и т. д.). Более современные тест-системы позволяют определять количественное значение антител, которое выражается в Международных единицах (ME) или нанограммах на литр.

Серая зона — это диапазон концентраций специфических антител, в который с равной вероятностью могут попадать как положительные, так и отрицательные пробы. В этом случае для уточнения результата необходимо повторить исследование с новой сывороткой, полученной через 1-2 недели.

Хламидийная инфекция

Chlamydia trachomatis — внутриклеточный микроорганизм, тропный к цилиндрическим эпителиальным клеткам, поэтому полученные пробы должны содержать как можно больше эпителиальных клеток. Некачественно отобранный материал приводит к появлению ложноотрицательных результатов.

Материалом для исследования на Chlamydia trachomatis являются мазки конъюктивы, шейки матки.

Традиционно «золотым стандартом» считают культуральный метод диагностики, предложенный в 1965 году J.B. Gordon и A.L. Quan. Это чувствительный и достоверный метод диагностики, который не дает ложноположительных результатов. Однако

48

______________________ Глава 3 -------------------------------------------

данный метод трудоемкий, дорогой и требует наличия необходимого оборудования и используется в настоящее время в исследовательских целях.

Исторически первым было открытие телец Гельберта-Прова-чека в цитоплазме пораженных клеток конъюнктивы, церви-кального канала, уретры, парауретральных ходов. Данный метод используется и в настоящее время. Недостатками его является то, что он информативен при острых формах и при инфекции нижнего полого тракта. Чувствительность данного метода составляет от 10 до 40%.

Распространенным методом диагностики хламидийной инфекции является метод прямой и непрямой иммунофлюоресценции. Он относительно простой и недорогой, основан на определении антигена Chlamydia trachomatis. Меченные флюоресцином моно-клональные антитела прикрепляются к элементарным тельцам, присутствующим в исследуемом материале. Чувствительность данного метода составляет 90-100%, специфичность — 85-100%. Однако данный метод, как и цитологический, информативен при инфицировании нижних отделов урогенитального тракта, а субъективизм в оценке результатов анализа ограничивает его диагностическую ценность.

Метод иммуноферментного анализа основывается также на выявлении антигена хламидий в пораженных клетках. Преимуществами его в диагностике хламидийной инфекции являются простота транспортировки и хранения полученных материалов, объективности оценки результатов, возможности автоматизации и одновременного исследования большого количества проб. К недостаткам относят высокий показатель ложноотрицательных и ложноположительных результатов, особенно при обследовании «бессимптомных» групп низкого риска, отсутствие возможности оценки качества забранного материала. Использование данного метода информативно также при инфекции нижнего отдела урогенитального тракта. В настоящее время этот метод не рекомендуется для исследования материала из конъюнктивы, однако он все чаще применяется при изучении материала из шейки матки и уретры в лабораториях, исследующих большое количество проб.

К молекулярным методам диагностики относятся все виды ПЦР, при которой выделяют возбудителя по нескольким копиям ДНК. Этот высокочувствительный метод позволяет с достоверностью определять хламидийную инфекцию, однако есть опас-

49

—-------------------------------- Глава 3 -------------------------------------

ность гипердиагностики хламидиоза при широком использовании этого метода для скринингового обследования пациентов вследствие невозможности дифференцирования мертвых и живых хламидий.

Наряду с выявлением антигенов или возбудителя в биоматериале достаточно широко используются серологические методы, основанные на выявлении противохламидийных антител и определения их титров в сыворотке больного. При неосложненных инфекциях половых органов специфические антитела не вырабатываются, однако повышенные уровни этих антител часто выявляются у женщин с воспалением тазовых органов или с пери-гепатитом.

Определение классов специфических иммуноглобулинов (IgM, IgA, IgG) в сыворотке крови пациентов позволяет выявить как ранние стадии инфекционного процесса верхнего отдела полового тракта женщины (IgM), так и обострение хронического (IgA, IgG), а также контролировать эффективность лечения по изменению уровня специфичных антител. В сомнительных случаях полезным может быть исследование увеличения титра антител, проведенное через 2 недели после первого исследования.

Определение специфических антител также информативно у новорожденных, поскольку обнаружение IgM у младенца с пневмонией указывает на хламидийную этиологию.

Говоря о методах диагностики хламидийной инфекции, необходимо отметить, что ни один из них не является универсальным. Поэтому рекомендуется проводить исследование на хламидийную инфекцию, используя одновременно как минимум два метода.

Цитомегаловирусная инфекция

Вирус может быть выделен из амниотической жидкости, глоточного мазка или мочи инфицированного младенца. Наиболее достоверно выделение в материале самого вируса или его ДНК. «Золотым стандартом» до сих пор остается вирусологический метод. Для выявления антигена используют реакцию иммунофлю-оресценции (РИФ), иммуноферментный анализ (ИФА), ДНК-гибридизацию, полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Специфические антитела IgM и IgG класса определяют иммуноферментным методом. Обнаружение ЦМВ-специфических IgM-антител в единичной пробе крови указывает на недавнюю первичную или текущую (рецидивирующую) инфекцию. Определение IgG CMV должно

50