6. Диагностикацитомегаловируснойинфекции

ЛабораторнаядиагностикаЦМВИосновананавыявлениивисследуемыхпробахЦМВ,ДНКЦМВ,антигеновилиантителкЦМВ.Соответственно,основнымиметодамилабораторнойдиагностикиЦМВИявляются:

микроскопическое,вирусологическое,молекулярно-генетическоеииммунохимическоеисследования(МарданлыС.Г.,КирпичниковаГ.И.,НеверовВ.А.,2011).ЗначениекаждогоизперечисленныхметодовдлявыявленияактивнойЦМВ-инфекциииподтвержденияманифестноготечениязаболеванияразлично.

Микроскопические методыисследования

Этопреимущественноцитоскопическоеисследованиеокрашенныхпрепаратовмочи,слюны,ликвораилисекционногоматериаладлявыявлениявнихспецифическиизмененных(«гигантскихклеток»).Методпроствисполнении,нетребуетспециальногооборудования,нообладаетнизкойчувствительностью(25-50%).КакпоказановисследованииGJDеmlеr(1991),толькоуоднойтретибольныхдетейссимптомамиврожденнойЦМВ-инфекцииудавалосьобнаружитьхарактерныегигантскиеклеткивмочеилислюне.Современныеотечественныеисследователи(МарданлыС.Г.,КирпичниковаГ.И.,НеверовВ.А.,2011)дляповышенияэффективностирекомендуютпроводитьобследованиецитологическимметодоммногократно.Напротив,обнаружениеЦМК(гигантскихклетокскрупнымядром,узкойкаймойцитоплазмыивнутриядернымивируснымивключениями)пригистологическомисследованиибиопсийныхиаутопсийныхматериаловпомнениюбольшинстваисследователей,являетсябезусловнымподтверждениемцитомегаловируснойприродыорганнойпатологии(КоротяевА.И.,1998;ШахгильдянВ.И.,2009;МарданлыС.Г.,2011).

Вирусологические методы исследования

Этиметодыоснованыназараженииисследуемымматериаломмонослойныхкультурфибробластовэмбрионачеловекаидиплоидныхкультурклетоклегкихчеловекаспоследующиммикроскопическимопределениемцитопатогенногодействия(ЦПД)вирусанаклетки.Попыткиобнаружитьболеечувствительныеклеточныесистемынедавалиположительныхрезультатов(GlеаvеsCА,HurshDА,MеyеrsJD,1992).Длязаражениякультурыклетокиспользуюткровь,мочу,слюну,сперму,секретцервикальногоканалаивлагалища,бронхиальныйаспират,секционныйматериал.Вомногихработах(КущА.А.,2006;ЧешекС.Г.,2000;ВолодинН.Н.,2002),посвященныхлабораторнойдиагностикеактивнойЦМВ-

инфекции,выделениецитомегаловирусаизбиологическихжидкостейназараженнойклеточнойкультуреназывают«золотымстандартом».ДеструкцияклеточногопластаподвоздействиемЦМВпоявляетсявразличныесроки(от14до60дней),чтообусловленоразличнымколичествомвирусависследуемомматериале.Понятно,чтоприналичииупациентатяжелойорганнойпатологии,требующейсрочногопроведенияэтиотропнойтерапии,клиницистнерасполагаетподобнымвременем.Вирусологическиеметодывысокоспецифичны,однако,следуетучитывать,чтовыделениевирусаизмочиилислюнынеявляетсяпризнаком острой инфекции.

ПоданнымН.В.Каражас(1997)иМHirsch(1994),цитомегаловирусможетвыделятьсявбиологическихжидкостяхвтечениенесколькихмесяцевпослевыздоровления.Вдругихисследованияхавторыотмечаютвысокуюстоимостькультуральногометодакаксерьезныйнедостаток(DrеwWL,StеmpiеnMJ,1997).

Дляускоренияполучениярезультатоввпоследниегодыширокоиспользуетсябыстрыйкультуральныйметод(БКМ),основанныйнаиспользованииспецифическихмоноклональныхантител(МКА),направленныхкбелкамЦМВвреакцияхиммунофлуоресценцииилипероксидазногоокрашивания.Методпозволяетвыявитьналичиевирусногоантигена(АГ)вклеткахчерез48-72часапослеинфицированиякультуры(180).ОкрашиваниеинфицированныхклетокМКАявляетсянетолькоболеебыстрым,ноиболееспецифичнымичувствительнымметодомопределенияинфекционноговирусавбиологическом материале(МеджидоваМ.Г,Федорова Н.Е.,КущА.А.,2003).

ВзарубежныхстранахнаиболеечастоприменяетсямодификацияБКМ–

«shеllviаl»,котораязаключаетсявсовместномцентрифугированииисследуемогоматериалаимонослояфибробластоввпериодабсорбции,позволяющаязначительноповыситьэффективностьвыявленияинфекционноактивногоцитомегаловирусавклиническихобразцах(PоwеrsJT,HоngS,MаyhеwCNеtаl.,2004).

Молекулярно-генетическиеметоды исследования (ПЦР-диагностика)

МногиеисследователиотмечаютнетолькобольшоедиагностическоезначениеопределенияДНКЦМВметодомПЦР,ноибесспорнуюпрогностическуюценностьэтогомаркера(QuаrnеrH,1995;GеrnаG,1995;ShinkаiM,1997;TоlаnRW,2011).Спомощьюданногометодаможновыявлятькакактивный,такилатентноприсутствующийвматериалевируснауровнечувствительностиодноговирусногогеноманамиллионисследуемых.Втожевремя,авторыобращаютвнимание,чтопридиагностикеинфекций,вызываемыхвирусами,длительноперсистирующимиворганизмечеловека,прогностическаяценностьположительныхрезультатовПЦРпривыявлениивирусногогеномабезучетаегоконцентрациидовольнонизка(WоlfDG,SpеctоrSА,1993;ШахгильдянВ.И.,ШипулинаО.Ю.,КаражасН.В.,2001).

Модифицированныеметодикипозволяютпроводитьколичественноеопределениевируснойнагрузки,существенноповышающееинформативностьположительныхответовдляпрогнозаразвитияипостановкидиагноза манифестнойЦМВ-инфекции(WаlkmslеyS,1998;WhitlеyRJ,JаcоbsоnMА,1998).Крометого,какипривирусологическихметодахисследования,доказательствоналичияДНКвирусависследуемойпробеимеетдиагностическуюценностьтолькоприисследованиикровииликвора,когдаоноуказываетнаактивныйхарактерпроцесса(ШахгильдянВ.И.,2001;МарданлыС.Г.,КирпичниковаГ.И.,НеверовВ.А.,2011).

Выявление вирусныхантигенов

ВнастоящеевремядляобнаруженияантигеновЦМВширокоиспользуютсяметодыфлюоресцирующихантител(МФА)винфицированныхкультурахклетокиливмононуклеарныхклеткахпериферическойкрови,которыеобрабатываютсямоноклональнымиантителамикα-илиβ-протеинамЦМВииммунофлуоресцентнымконъюгатом,азатемисследуютсяподмикроскопомвультрафиолетовомсвете.МФАпозволяетвыявитьвирусныеантигенывслюне,моче,отделяемомцервикальногоканала,влагалища,уретры,сперме.Егоспецифичностьсоставляет60-70%.МФА–этодостаточнобыстрыйметод, однако

егоприменение,помимопотребностивспециальномоборудовании,имееттежеограничения,чтоидлядругихметодоввыявленияЦМВ.

Выявление специфическихантителкЦМВ

Диагностическоезначениеимеетналичиеидинамикавсыворотке(плазме)кровититровспецифическихантителклассовIgMиIgG,чтоможетбытьопределеноприисследованиитакназываемых«парных»сывороток(PassR,WeberТ,WhitleyRJ,1999).

ВыявлениеспецифическихIgM-иIgG-антителимеетсмыслпроводитьпридиагностикепервичногоинфицированияиливрожденнойинфекции.ВыявлениеIgM-антителвкровиплода,полученнойкордоцентезом,указываетнавнутриутробноеинфицирование.Врожденнаяинфекцияможетбытьподтвержденалибопутемвыделениявирусаизглоточногомазкавтечениепервых3недельжизни,либопутемвыявлениявкровиребенкаспецифическихIgM-антител,которыеуказываютнанедавноразвившуюсянеонатальнуюилипостнеонатальнуюинфекцию.Серонегативностьпациентов,подвергшихсяиммуносупрессивнойтерапии,можетрассматриватьсякакфакторриска,посколькупервичнаяинфекциянафонеиммуносупрессииможетпротекатьсвыраженнымиосложнениями.Нонужнопомнить,чтовыработкаантителвподобнойситуацииможетбытьзамедлена(PassR,WeberТ,WhitleyRJ,1999;Рахманова А.Г.,КирпичниковаГ.И.,НеверовВ.А.,Ремезов А.П.,2003).

Выявитьантителаможноспомощьюиммуноферментногоанализа(ИФА),реакциинейтрализации(РН),реакциисвязываниякомплемента(РСК).Однакоклассическиесерологическиетестывсилусеропозитивностибольшейчастичеловеческойпопуляциисложныдляинтерпретации.ПоэтомуосновнымметодоманализанасегодняшнийденьявляетсяИФА,сочетающийдостаточнуюэкспрессность,высокуючувствительностьиспецифичностьспростотойисполненияиотносительнойдешевизной.ИсследованиекровипациентананаличиеспецифическихантителклассаIgМи/илиантителклассаIgGнедостаточнонидляустановленияфактаактивнойрепликацииЦМВ,нидляподтвержденияманифестноготечениязаболевания.Наличиеанти-ЦМВIgGв

кровиозначаетлишьфактвстречисвирусом.УноворожденногоребенкаIgGантителавкровиявляютсявбольшинствеслучаевматеринскимиинеслужатдоказательствомзараженияЦМВ.КоличественноесодержаниеIgGантителвкровинекоррелируетнисналичиемзаболевания,нисактивнымбессимптомнымвариантомтеченияинфекции,нисрискомвнутриутробногозараженияребенка.Лишь4-хкратноеиболеенарастаниеколичестваанти-ЦМВIgGв«парныхсыворотках»приобследованиисинтерваломв14-21деньимеетопределенноедиагностическоезначение.Отсутствиеанти-ЦМВIgGвсочетаниисналичиемспецифическихIgМантителсвидетельствуетобостройЦМВИ.Выявлениеанти-ЦМВIgМудетейпервыхнедельжизниявляетсяважнымкритериемвнутриутробногозаражениявирусом,носерьезнымнедостаткомопределенияIgМантителслужитихчастоеотсутствиеприналичииактивногоинфекционногопроцессаинеменеечастыеложноположительныерезультаты,связанныесприсутствиемвсывороткекровибольногоревматоидногофактора,активнойрепликациейдругихгерпесвирусов,аутоиммуннымипроцессами,атакжекачествомиспользуемыхтест-систем.ОналичииостройЦМВИсвидетельствуютнейтрализирующиеIgМантитела,присутствующиевкровинеболее60днейотмоментазаражениявирусом.Определениеиндексаавидностианти-ЦМВIgG,характеризующегоскоростьипрочностьсвязыванияантигенасантителом,имеетопределеннуюдиагностическуюипрогностическуюценность.Выявлениенизкогоиндексаавидностиантител(менее0,2илименее30%)подтверждаетнедавнее(втечение3месяцев)первичноезаражениеЦМВ.

Каквидноизвышеизложенного,проблемадиагностикиЦМВ-инфекциинеможетсчитатьсярешенной.ОкончательноепрогностическоеидиагностическоезначениекаждогоизлабораторныхмаркеровактивнойрепликацииЦМВвотношенииклиническивыраженнойЦМВ-инфекциинеустановлено.Данныелитературыоврачебнойтактикевситуации,когданеобходимоподтвердитьклиническийдиагнозЦМВ-инфекцииспомощьюлабораторныхтестов,противоречивы.Дляврача-клинициставажнопоставитьправильныйдиагноз,атакжезнатьстепеньактивностиинфекционногопроцессасцельюназначения

противовируснойтерапиипритехилииныхвариантахклиническоготеченияЦМВ-инфекции.Помимоспецифическихлабораторныхданных,необходимоучитыватьклиническиепроявления,анамнезирезультатыдругихметодовисследования(УЗИ,биохимиикрови,иммунограммы,преждевсегосостоянияТ-клеточногоиммунитетаидр.).Правомернаяинтерпретациялабораторныхпоказателей,определениеформыитипатеченияболезниспособствуютвыборуоптимальнойтерапии(Вартанян Р.В.,2003).