2 курс / Нормальная физиология / ТКАНЕВАЯ ТЕРАПИЯ. ПЛАЦЕНТА

Т.П. ЖУРАВЛЕВА

Выделение и изучение белковых компонентов

из плаценты человека, обладающих противоопухолевой активностью

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 1968

611

https://t.me/medicina_free

Работа выполнена на кафедре микробиологии Центрального ордена Ленина института усовершенствования врачей.

Научные руководители:

З.В. Ермольева, действительный член АМН СССР, профессор Н.В. Покидова, кандидат химических наук

Официальные оппоненты:

В.А. Шорин, доктор медицинских наук, профессор А.Б. Силаев, доктор химических наук, профессор

Учреждение, давшее отзыв о научно-практической ценности работы – Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков МЗ СССР.

Защита состоялась в 1968 г. на заседании межинститутского совета по микробиологии и эпидемиологии АМН СССР, Москва.

612

https://t.me/medicina_free

Химиотерапия злокачественных опухолей достигла известных успехов как в эксперименте, так и в клинике и продолжает быстро развиваться.

Однако перед онкологами продолжает стоять задача создания новых противоопухолевых веществ и изыскания новых источников их получения.

Поиски новых противоопухолевых веществ и источников их выделения являются одной из важнейших проблем современной онкологии.

Лаборатория, руководимая действительным членом АМН СССР, профессором 3. В. Ермольевой, в течение многих лег занимается поисками и выделением биологически активных веществ природного происхождения – продигиозана, интерферона, лизоцима, протамина, препаратов из плаценты (З. В. Ермольева с сотр. 1963, 1965; Т. Г. Терентьева, 1964, И. И. Смертенко, 1967).

Предпосылкой к поискам новых противоопухолевых веществ среди белковых соединений послужили сообщения о биологической активности протаминов, гистонов (И. Б. Збарский, К. А. Перевощикова, 1954; В. М. Бреслер, В. И. Воробьев, 1963; К. Феликс, 1959) и возможность использованияпептидовв качественосителейцитотоксическихгруппировок (И. Л. Кнунянц с сотр., 1960; Л. Ф. Ларионов, 1962).

Предполагается, что вещества этойгруппыдействуютна обмен опухолевойклеткипотипуантиметаболитов,спреимущественнымвключением в белки опухолевой клетки по сравнению с нормальными, что может обеспечить их большую избирательность (А. К. Белоусова, 1965).

Целью настоящего исследования явилось выделение индивидуальных компонентов, обладающих противоопухолевой активностью, из плаценты человека, их очистка, изучение химического строения и некоторых физико-химических свойств, определяющих специфичность биологических функций.

На ранних этапах исследования выделение активных веществ проводилось по методике Натини Л. Г. (1946). При использовании этой методики получались нестандартные препараты, сильно отличающиеся по активности. Вероятнее всего, изменения в активности препаратов можно объяснить присутствием протеиназ, расщепляющих белки.

Вначале мы получали биологически активные вещества из различныхтканейкрупногорогатогоскота:печени,почек,поджелудочной железы, мозга, сердца, легких, семенников, крови животных, а также плаценты человека.

Поскольку выделенные препараты предполагалось применять в медицинской практике, источником их получения в дальнейшем служила плацента человека.

Плацентубралив сухойледот здоровыхмолодыхженщин,без отягощенного анамнеза. Замороженную плаценту измельчали в гомоге-

613

https://t.me/medicina_free

низаторе, предварительно отделив от нее пленку и пуповину. Измельченную ткань смешивали с физиологическим раствором в отношении 1:1, так как имеются данные, что при применении 0,9 % раствора NaCl извлекается максимум белка.

Для получения препаратов с постоянным составом и физико-хими- ческими свойствами проводились опыты в направлении инактивации катепсинов, присутствующих в плаценте и вызывающих распад и дезагрегацию белков. С этой целью экстракцию проводили при pH 2 и 9, сильно отличающихся от оптимальных значений pH для проявления действия катепсинов. Затем гомогенат подвергали трехкратному поочередному замораживанию и оттаиванию для разрушения клеточных оболочек и сохранения белка в нативном состоянии. Осадок удаляли из экстракта центрифугированием при 1500 об / мин в течение 30 минут. Для отделения нуклеиновых кислот от белка применяли осаждение спиртом в кислой среде до конечной концентрации 80 %. Водно-спирто- вой раствор снова центрифугировали для отделения выпавшего осадка и концентрировали под вакуумом при 30° до полного удаления спирта.

Препараты, выделенные на ранних этапах исследования, содержали много балластных веществ – неактивных белков и солей. Поэтому дальнейшее исследование проводилось в направлении очистки препаратов.

Препаративное разделение белковых компонентов, выделенных из плаценты человека, осуществляли с помощью ионообменной хроматографии на амберлите CG-50 в условиях градиента концентрации ацетатно-бариевого буфера от 0,1 до 2 М при pH 6,7.

Методом ионообменной хроматографии удалось выделить 5 фракций, присутствующих в препарате и повысить противоопухолевую активность одной из них в 75 раз. Однако выход этой фракции был очень незначительным, поэтому накопление очищенных компонентов для изучения в эксперименте проводилось методом гелевой фильтрации на сефадексе Г-100.

При гелевой фильтрации на сефадексе Г-100 элюирование проводили дистиллированной водой. Скорость вытекания равнялась 4–5 мл / час. Оптическую плотность полученных фракций определяли спектрофотометрически при 280 ммк на спектрофотометре СФ-4.

Содержание белка определяли по методу Лоури. Противоопухолевую активность фракций и исходного препарата

испытывали в культуре тканей и на экспериментальных животных. Фильтрация через гель сефадекса Г-100 позволила выделить 2

компонента, различающиеся спектрофотометрическими свойствами и биологической активностью.

Выделенные фракции значительно отличались по своему действию от исходного препарата. В концентрации 5 мкг / мл коэффи-

614

https://t.me/medicina_free

циент подавления исходного препарата составлял 10 %; I компонен-

та – 100% ; II – 65 %.

Таким образом, примененный метод очистки позволил повысить противоопухолевую активность фракций по сравнению с исходным препаратом в 10 раз.

При изучении белкового препарата необходимо иметь его всестороннюю характеристику, определяемую рядом физико-химических показателей.

Противоопухолевое действие веществ определяется в значительной степени его физико-химическими свойствами, от которых зависит проникновение и распределение веществ в тканях организма, способность вступать в соединение с различными компонентами клетки.

Молекулярный вес белковых компонентов играет важную роль вопределенииихпротивоопухолевыхсвойств,таккак мономерыосновныхаминокислотнеоказываюттормозящегодействиянаростопухоли.

Молекулярный вес белковых компонентов определялся нами методом гелевой фильтрации на сефадексе Г-100.

Стеклянная хроматографическая колонка размером 2,2×65 см заполнялась набухшим гелем и уравновешивалась фосфатным буфером pH 7,7. После уплотнения сефадекса колонка калибровалась белка- ми-метчиками с молекулярными весами от 14.000 до 69.000.

Вкачестве метчиков использовались альбумин, карбоксипептидаза, химотрипсин, трипсин, лизоцим, рибонуклеаза. Метчики в количестве 5 мг, растворенные в 6 мл элюирующего буфера, наносились на колонку. Элюирование производилось 0,1 М фосфатным буфером pH 7,7. Скорость элюирования была постоянна на всем протяжении опыта и равна 7 мл/ час.

Положение белков-метчиков определялось спектрофотометрически, и измерялись элюирующие объемы для каждого из белков.

При нанесении элюирующих объемов белков против логарифмов их молекулярных весов получена калибровочная прямая линия для белков-метчиков. Очищенные белковые компоненты подвергались гелевой фильтрации на сефадексе Г-100 в тех же условиях.

Пользуясь полученной нами прямой зависимостью между элюирующими объемами и логарифмами их молекулярных весов, нашли, что молекулярный вес I фракции равен 88 100 ± 7000; II фракции –

17 900 ± 770.

Изоэлектрические точки белковых компонентов определялись при помощи ионообменной хроматографии белков-метчиков и фракций исходного препарата на колонке с карбоксиметилсефадексом марки С-50.

Вкачестве белков-метчиков применялись: гамма-глобулин, интерферон, рибонуклеаза, химотрипсин, лизоцим. Белки-метчики и фрак-

615

https://t.me/medicina_free

ции препарата вносились в колонку в виде раствора в элюирующем буфере.

Элюирование производилось 0,1 М фосфатным буфером с pH на 1,0 единицу ниже изоэлектрической точки наносимого белка в градиенте pH 0,1 М фосфатного буфера, до значения pH на 0,8–1,0 единицу больше значения изоэлектрической точки испытуемого белка.

Фракции препарата хроматографировались на колонке с КМ-сефа- дексом в аналогичных условиях.

Изоэлектрические точки фракций препарата получены путем сложения значения pH в максимуме пика при их хроматографировании и среднего отклонения измеренных значений изоэлектрической точки для белков-метчиков от известных в литературе.

Изоэлектрические точки, полученные нами методом хроматографирования на КМ-сефадексе в градиенте pH равны для I фракции –

10,6; для II – 9,8.

В таблице 1 приведены значения молекулярных весов и изоэлектрических точек фракций препарата.

Таблица 1

Молекулярные веса и изоэлектрические точки фракций препарата

Как видно из таблицы, молекулярные веса фракций высокие, а изоэлектрические точки лежат в щелочной зоне, что обусловливает возможность их взаимодействия с компонентами клетки, несущими отрицательный заряд.

Для нас представляло интерес провести спектрофотометрическое исследование белковых компонентов, чтобы установить характер абсорбционной кривой.

Анализ абсорбционной кривой свидетельствует, что фракции, выделенные методом гелевой фильтрации через сефадекс Г-100, являются чистым не денатурированным белком, не содержащим примеси нуклеиновых кислот, о чем свидетельствует форма кривой (минимум поглощения при 250 ммк и максимум поглощения при 280 ммк).

Установление аминокислотного состава и концевых групп в молекуле белкового препарата представляет практический и теорети-

616

https://t.me/medicina_free

ческий интерес в связи с изучением специфических биологических свойств белков.

Показано, что противоопухолевая активность пептидов зависит от характера и последовательности аминокислот, составляющих пептидную цепь и от природы конечной аминокислоты (Кнунянц И. Л.

с сотр., 1960; Ларионов Л. Ф., 1962).

Нами определен качественный и количественный аминокислотный анализ II фракции препарата, которая изучалась в культуре тканей и в опытах на животных.

Качественный аминокислотный состав исследовался методом бумажной хроматографии в системе н-бутанол, уксусная кислота, вода, в различных отношениях.

Во II фракции обнаружены следующие аминокислоты: аргинин, лизин, гистидин, серин, глицин, глютаминовая кислота, аланин, фенилаланин, лейцин, валин, триптофан, цистин.

Исследование количественного аминокислотного анализа II фракции проводили на автоматическом аминокислотном анализаторе фирмы «Эванс Электроселениум ЛТД», Англия.

Получены «выходные кривые» стандартной смеси аминокислот, входящих в состав II фракции и определены их микро-молярные коэффициенты поглощения.

Количественный аминокислотный состав приведен в таблице 2. Определение N-концевых групп исходного препарата и фракций проводили динитрофторбензольным методом. N-концевыми группа-

ми исходного препарата I и II фракций являются валин и лизин.

Для проверки гомогенности фракций использовали ряд физико-хи- мических методов, дополняющих друг друга, – гелевая фильтрация, ионообменная хроматография на амберлите CG-50, электрофорез, определение N-концевой аминокислоты.

При ионообменной хроматографии на амберлите CG-50 элюирование проводили 0,2 М фосфатным буфером при pH 6,4 и 6,72.

Фракции собирали со скоростью 3 мл/ час и анализировали спектрофотометрически.

В результате ионообменной хроматографии обнаружено наличие одного пика в обеих фракциях, что указывает на их гомогенность.

Гомогенность I и II фракции подтверждена электрофоретическим анализом. Получены однородные электрофоретические диаграммы, на которых имеется только одна вершина.

Изучалось действие белкового компонента с молекулярным весом 17 900, изоэлектрической точкой 9,8 на опухолевые клетки линии НЕр-2 и HeLa (И. И. Смертенко, 1967). Показано, что под влиянием препарата наблюдалось снижение количества жизнеспособных клеток и угнетение их митотической активности. Нарушался метаболизм

617

https://t.me/medicina_free

опухолевых клеток – снижалось содержание ДНК, РНК и суммарного белка.

Эти данные хорошо согласуются с результатами опытов на животных, проведенных Н. А. Пастернак, В. А. Шендерович и Н. И. Гивенталем. По их данным, белковый компонент, выделенный из плаценты человека, оказывал выраженное цитостатическое действие на подкожно имплантированные опухоли: карциному Эрлиха и S-37. Процент торможения роста опухолей колебался от 54 до 70 %. Наблюдалось усиление противоопухолевого эффекта малых доз цитостатических препаратов посредством сочетания их с белковым компонентом.

Таблица 2

Количественный аминокислотный состав II фракции

618

https://t.me/medicina_free

Проведенное исследование позволило определить природу, физи- ко-химические, химические и биологические свойства белковых компонентов, содержащихся в плаценте, и показало целесообразность дальнейшего изучения этих природных веществ.

Выводы

1.Показана возможность выделения белковых компонентов из плаценты человека, обладающих противоопухолевой активностью.

Для получения препаратов с постоянным составом и физико-хи- мическими свойствами проводились опыты в направлении инактивации катепсинов, присутствующих в плаценте и вызывающих распад

идезагрегацию белков. С этой целью экстракция проводилась при pH 2 и 9, сильно отличающимся от оптимального действия катепсинов. Это позволило получать стандартные препараты, содержащие высокомолекулярный компонент. С целью разрушения клеточных оболочек гомогенат подвергали трехкратному поочередному замораживанию и оттаиванию. Применялось осаждение спиртом в кислой среде для полного отделения нуклеиновых кислот от белка.

2.Предложены условия разделения экстрактов плаценты, выделенных при pH 2 и 9.

Фильтрация через гель сефадекса Г-100 позволила выделить из экстракта плаценты 2 компонента, различающихся спектрофотометрическими свойствами и биологической активностью. Примененный метод очистки позволил повысить противоопухолевую активность фракции по сравнению с исходным препаратом в 10 раз.

Методом ионообменной хроматографии на амберлите CG-50 в ус- ловияхградиентаконцентрацииацетатно-бариевогобуфераот 0,1до 2

Мпри pH 6,7 из экстракта плаценты удалось выделить 5 фракций и повысить противоопухолевую активность одной из них в 75 раз. Однако выход этой фракции был очень незначительным, поэтому накопление очищенных компонентов для изучения в эксперименте проводилось методом гелевой фильтрации на сефадексе Г-100.

3.Молекулярные веса выделенных компонентов определялись ме- тодомгелевойфильтрациинасефадексеГ-100.Значениямолекулярных весов получены на основании зависимости, установленной для элюирующих объемов белков-метчиков и логарифмов молекулярных весов.

Молекулярный вес I фракции найден равным 88 100 ± 7000, II фрак-

ции 17 900 ± 770.

4.Для определения изоэлектрических точек использован метод хроматографирования на КМ-сефадексе белковых компонентов

истандартных белков в градиенте фосфатного буфера (постоянство буферного состава и ионной силы) в одинаковых условиях.

619

https://t.me/medicina_free

Изоэлектрические точки изучаемых белковых компонентов, определенные данным методом, лежат при pH 10,6 для I компонента и 9,8 – для II.

5.Спектрофотометрическое исследование показало, что компоненты, выделенные методом гелевой фильтрации на сефадексе Г-100, являются чистыми, не денатурированными белками, не содержащими примеси нуклеиновых кислот.

6.При изучении качественного и количественного аминокислотного состава II компонента обнаружены следующие аминокислоты: лизин, гистидин, аргинин, аспарагиновая кислота, серин, глютаминовая кислота, пролин, аланин, валин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, глицин.

7.Концевые группы исходного препарата и белковых компонентов определены методом динитрофенилирования.

N-концевыми группами I и II компонента являются валин и лизин.

8.Гомогенность полученных фракций доказана ионообменной хроматографией на амберлите CG-50 методом свободного электрофореза и определения N-концевой аминокислоты.

Список работ по теме диссертации

1.Испытание действия на опухолевые клетки в культуре очищенных препаратов основных полипептидов из животных тканей. Антибиотики, 1965, № 2, стр. 137–140.

2.Изучение аминокислотного состава основных полипептидов животного происхождения методом хроматографии на бумаге. Антибиотики, 1966, № 7, стр. 594–598.

3.Изучение противоопухолевого действия основных полипептидов в эксперименте. Антибиотики, 1966, № 12, стр. 1095–1097.

4.Изучение противоопухолевого действия полипептидов, выделенных из крови млекопитающих. В сб. трудов молодых ученых «Современные проблемы гематологии и переливания крови», 1967, стр. 368–372.

5.Применение гелевой фильтрации для определения молекулярного веса белков и высокомолекулярных полипептидов. Антибиотики, 1967, № 12. стр. 1102–1104.

6.Выделение, очистка и некоторые свойства основных полипептидов из плаценты человека и различных органов крупного рогатого скота. В сб. ЦОЛИУВ «Антибиотики, бактериальные полисахариды, интерферон» М., 1967, стр. 167–172.

620

https://t.me/medicina_free