6 курс / Эндокринология / Эндокринология_и_метаболизм_Фелиг_Ф_,_Бакстер_Дж_Д_,_Бродус_А_Е

1 -гидроксилазы и в результате—количество 1,25 (ОН)2D, продуцируемое почками. К таким факторам относятся пролактин, половые стероиды, глюкокортикоиды и инсулин. Относительное значение этих гормонов в регуляции биосинтеза витамина D в настоящее время не известно, по возможность участия некоторых гормонов гипофиза половых желез и поджелудочной железы в регуляции биосинтеза и метаболизма витамина D открывает новые интересные области исследования сложных взаимоотношений гормональных эффектов в регуляции метаболизма кальция в костях скелета.

Глава 4. ДЕЙСТВИЕ ГОРМОНОВ: РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИИ КЛЕТОКМИШЕНЕЙ БЕЛКОВЫМИ, ТИРЕОИДНЫМИ И СТЕРОИДНЫМИ ГОРМОНАМИ

К. ДЖ. КЭТТ (К, J. САТТ), М. Л. ДЮФО (М. L. DUFAU)

ВВЕДЕНИЕ: ОБЩИЕ АСПЕКТЫ ДЕЙСТВИЯ ГОРМОНОВ

Все формы биологической регуляции основаны на взаимодействии между комплементарными молекулами, приводящем к изменению свойств и функции одного или обоих лигандов. Этот тип-передачи молекулярной информации в законченном виде используется рецепторами гормонов и регуляторными ферментами — системами, обладающими многими общими чертами. Действительно, большинство «рецепторов» гормонов и трансмиттеров непосредственно или косвенно сопряжено с ферментными белками, усиливающими эффект связывания лиганда путем передачи его на последующие метаболические и биосинтетические этапы. В самом простом смысле, гемоглобин выполняет роль рецептора кислорода и служит одним из многих связывающих и/или транспортных белков, обеспечивающих распределение небольших молекул в организме. В плазме обнаружено огромное число связывающих белков для циркулирующих лигандов, в том числе стероидные и тиреоидные гормоны, а также металлы, липиды и витамины. Связывание лигандов с такими белками, как правило, не изменяет активности молекул носителя, которые служат главным образом резервуаром, а иногда средством транспорта гормональных и других лигандов. Такие связывающие белки поэтому аналогичны рецепторам только по своим «распознавательным» свойствам.

Особенностью клеточных рецепторов гормонов, если не считать их локализации

вчувствительных к гормонам тканях, является способность связывать природные или синтетические гормональные лиганды с высокой специфичностью и активировать реакции, опосредуемые и детерминируемые эффекторными системами клетки-мишени. Способность распознавать и активировать означает, что для перевода внешних сигналов

вреакции клетки-мишени рецепторная молекула должна обладать двумя отдельными участками или конформациями. Существование таких связывающих и активирующих доменов в рецепторных белках доказывается данными исследования разнообразных гормональных рецепторов, расположенных как в цитоплазме, так и на плазматической мембране клеток-мишеней.

Рис. 4—1. Общие механизмы действия гормонов на клетки-мишени.

КЛАССЫ ДЕЙСТВИЯ ГОРМОНОВ И ДОМЕНЫ ГОРМОНАЛЬНОГО КОНТРОЛЯ

Эволюция механизмов гормонального контроля в многоклеточных организмах обусловила развитие двух четко определенных регуляторных систем, интегрирующих функции клеток-мишеней эндокринных воздействий (рис. 4—1). Более широко распространена система, контролируемая стероидными гормонами, которые регулируют ферменты, определяющие метаболическую и секреторную активность огромного числа периферических тканей. Эти относительно неполярные и гидрофобные гормоны секретируются надпочечниками и половыми железами и разносятся кровью в связанном с белками плазмы виде, чтобы сохранять эффективную концентрацию свободного стероида во внеклеточной жидкости. Свободные стероиды, по-видимому, диффундируют во все клетки, но оказывают свое метаболическое действие только на ткани-мишени, обладающие специфическими внутриклеточными связывающими белками. Эти внутриклеточные рецепторы в свою очередь опосредуют влияние стероида на ядерные процессы, определяющие синтез белка. В некоторых клетках эффекты стероидов проявляются синтезом регуляторных ферментов, контролирующих метаболические реакции, что подтверждается действием кортикостероидов на углеводный и белковый обмен. В других, более специализированных, тканях стероиды ответственны за клеточную дифференцировку и образование специфических белков, высвобождаемых в кровь или утилизируемых местно для вторичных процессов, что наблюдается в репродуктивных тканях, находящихся под контролем половых стероидов. Как правило, стероиды надпочечников индуцируют образование ферментов, контролирующих внутриклеточные метаболические функции, тогда как половые стероиды стимулируют также синтез белков, секретируемых клеткой-мишенью и участвующих в механизме размножения. Эти две крайности значительно перекрываются, и многие эффекты половых стероидов оказываются связанными с регуляцией внутриклеточных метаболических процессов в периферических тканях-мишенях. Анализ действия половых стероидов, таких, как эстрадиол и прогестерон, на синтез белков яйцеводов, в том числе на овальбумин и авидин, привел к существенному прогрессу в понимании молекулярной биологии эффектов стероидных гормонов.

Свойства и действия тиреоидных гормонов во многих отношениях аналогичны таковым стероидов, несмотря на их очевидное сходство с пептидными гормонами и аминокислотными трансмиттерами. Тиреоидные гормоны, например, обладают липофильными свойствами, что более характерно для стероидов, чем для пептидных гормонов с их гидрофильной природой. Подобно этому, тиреоидные гормоны в крови в основном связаны со специфическими белками плазмы и диффундируют в свои клетки-мишени через небольшой пул свободного внеклеточного гормона. Тиреоидные гормоны также действуют путем связывания с внутриклеточными рецепторами и, подобно стероидам, оказывают в основном свое действие путем регуляции ядерных процессов, что приводит к изменению биосинтетической и метаболической активности клетки-мишени [2].

В отличие от преимущественно ядерных эффектов стероидных и тиреоидных гормонов, действие пептидных гормонов опосредовано рецепторами клеточной поверхности, регулирующими ферментные системы плазматической мембраны и цитоплазмы. Это справедливо и в отношении простых трансмиттерных молекул, таких, как катехоламины и ацетилхолин, и в отношении многих пептидных, белковых и гликопротеиновых гормонов. Такие молекулы взаимодействуют со специальными участками плазматической мембраны, которые распознают и связывают регуляторные лиганды [3]. Специфическое связывание с этими рецепторами клеточной поверхности изменяет активность связанных с мембраной эффекторных ферментов, которые, контролируя мембранные и/или цитоплазматические процессы, опосредуют тем самым острые и долговременные изменения функции клетки-мишени. В некоторых тканях-мишенях, таких, как зависимые от гипофиза периферические эндокринные органы (надпочечники, щитовидная и половые железы), от действия пептидных гормонов зависит сохранение клеточной дифференцировки и функции. В этом смысле, тропные гормоны гипофиза (АКТГ, ТТГ, ФСГ) обладают некоторым функциональным сходством с половыми стероидами, поддерживающими дифференцированное состояние и секреторную активность гормонзависимых клеток-мишеней. Другие пептидные гормоны, такие, как инсулин, пролактин и СТГ, по своей функции больше напоминают стероидные гормоны надпочечников, так как вызывают быстрые и долговременные изменения метаболических процессов, а не обеспечивают дифференцировку клеток-мишеней.

Приведенные обобщения относительно метаболических эффектов стероидных, тиреоидных и пептидных гормонов, удобны для широкой функциональной классификации гормональных эффектов, но не следует упускать из виду областей перекрывания биохимических функций этих разных классов лигандов. По существу гормоны представляют собой циркулирующие «сигналы» или информационные посылки, которые, будучи узнанными и связанными соответствующими поверхностными или внутриклеточными рецепторами, вызывают запрограммированные реакции своих клеток-мишеней. Проводить общее различие между стероидными и тиреоидными гормонами, с одной стороны, и пептидными гормонами, с другой, как регуляторами «ядерных» и «цитоплазматических» процессов соответственно удобно для дифференцирования крайних особенностей действия этих лигандов. В то же время известно, что стероидные и тиреоидные гормоны оказывают и вне-ядерное действие, а некоторые пептидные гормоны влияют, по-ви- димому, и на экспрессию генов. В связи с этим с позиций способности регулировать метаболическую активность клетки и вызывать функциональные реакции на стимуляцию, два общих класса гормонов не имеют абсолютных различий.

РЕЦЕПТОРЫ ПЕПТИДНЫХ ГОРМОНОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ

коррелирует с активацией характерных для клеток-мишеней реакций, что указывает на биологическую значимость таких мест в качестве рецепторов гормонов. В других тканях пептидные рецепторы идентифицированы условно только по высокому сродству и специфичности связывания биологически активных форм гормональных гомологов. Применение конкурентных антагонистов (если они существуют), блокирующих как связывание гормона, так и последующую реакцию клетки-мишени, позволило получить дополнительные доказательства биологической значимости нескольких гормональных рецепторов. Некоторые рецепторные места, например для ацетилхолина и катехоламинов, охарактеризованы с помощью меченых антагонистов. Относительно низкое сродство ацетилхолиновых рецепторов к холинергическим лигандам или низкая концентра-

ция специфических -адренергических мест на клетках-мишенях создают трудности для характеристики этих рецепторов путем исследований с применением меченых агонистов.

Рис. 4—2. Концепция, предложенная Sutherland, согласно которой гормону отводят роль первого медиатора, а цАМФ (или другим веществам) — второго (внутриклеточного) медиатора, с помощью которого осуществляется действие пептидных гормонов

(Sutherland, Robison [4] в модификации).

Мнение о клеточной мембране как о месте действия пептидных гормонов сформировалось на основании наблюдений Sutherland, согласно которым взаимодействие катехоламинов с плазматической мембраной эритроцитов голубя приводит к активации аденилатциклазы [4]. После этого было показано, что многие пептидные гормоны связываются с рецепторами плазматической мембраны и влияют на локализованную в ней активность, такие, как аденилатциклаза или механизмы ионного транспорта (рис. 4—2). О поверхностной локализации рецепторов пептидных гормонов свидетельствует и тот факт, что кратковременное воздействие гормона вызывает длительную реакцию клеток-мишеней, которую можно отнести за счет связанного гормона, а также способность специфических антисывороток быстро прекращать действие пептидных гормонов in vitro. Известно также, что ферменты или другие агенты, влияющие на мембранные белки и липиды, модифицируют или ликвидируют способность пептидных гормонов стимулировать аденилатциклазу. Наиболее веские доказательства локализации рецепторов пептидных гормонов на плазматической мембране были получены в авторадиографических исследованиях и прямых опытах по связыванию меченых биологически активных гормонов с препаратами мембран или интактными клетками. Эти подходы позволили точно выяснить локализацию и параметры связывания клеточных рецепторных участков, а также их функциональную связь с реакциями клетки-мишени.

Способность пептидных гормонов взаимодействовать с клетками-мишенями (или наоборот) должна зависеть от присутствия специфических участков связывания на плазматической мембране (рецепторов), которые извлекают несущие информацию молекулы из внеклеточной жидкости. Так, «осведомленность» клеток пучковой зоны коры надпочечников в отношении гипофизарных регулирующих влияний определяется концентрацией и профилем секреции АКТГ, поступающего к надпочечным железам. Чрезвычайно низкие концентрации (около 10~10 M) гипофизарных гормонов в крови при миллионнократном избытке других белков требуют, чтобы рецепторы клеток-мишеней обладали как высокой специфичностью (позволяющей узнавать гормон), так и высоким сродством к гормону (позволяющим связывать его при низкой концентрации). Хорошо изученный класс рецепторов для «традиционных» пептидных гормонов (таких, как тропные пептиды гипофиза и гормоны желудочно-кишечного тракта) пополнился аналогичными участками для местных и дистантных трансмиттерных молекул (таких, как ацетилхолин, катехоламины и простагландины), а позднее и для группы, состоящей примерно из 20 нейропептидов (как ранее известных, так и недавно обнаруженных), которые регулируют, по-видимому, функцию периферической и центральной нервной системы. Это огромное число «пептидных» гормонов характеризуется высоким зарядом и относительной гидрофильностью, отсутствием значительного связывания с белками плазмы и способностью связываться со специфическими распознающими участками на открытой области рецепторных молекул. встроенных в плазматическую мембрану кле- ток-мишеней.

Считают, что другая специализированная область внутренней, ассоциированной с мембраной, части рецепторов пептидных гормонов взаимодействует с внутримембранной частью эффекторных молекул или ферментов, таких, как аденилатциклаза, чей каталитический домен доступен с внутренней, цитоплазматической, поверхности

клеточной мембраны. Хотя в настоящее время известно, что многие пептидные гормоны после связывания с поверхностными рецепторами все же проникают в клетку, первоначальное взаимодействие с наружной поверхностью плазматической мембраны является необходимым условием стимуляции реакций клеток-мишеней, поскольку внутриклеточное введение пептидных гормонов не вызывает характерных реакций таких клеток. За связыванием гормона с поверхностным рецептором наступает активация одной или более мембранных эффекторных систем, определяющая изменения в механизмах транспорта и распределения ионов, а также активацию цитоплазматических процессов, которые регулируют функцию клетки-мишени. Многие из этих этапов активации включают, по-видимому, фосфорилирование мембранных или цитоплазматических белков, что приводит к изменению ферментативных функций, ответственных за транспорт пли метаболизм молекул, играющих важную роль в клеточной активности. Главным мембранным ферментом, регулируемым пептидными гормонами, является аденилатциклаза, катализирующая образование цАМФ, необходимого для процессов фосфорилирования, возникающих при стимуляции клетки-мишени. К другим мембранным ферментам, на активность которых влияет гормон-рецепторное взаимодействие, относятся ферменты, участвующие в кругообороте инозитола, метилтрансферазы, принимающие участие в метилировании фосфолипидов, а также фосфолипазы, ответственные за деацилирование мембранных фосфолипидов. Последний процесс служит источником образования предшественников (таких, как арахидоновая кислота) простагландинов, тромбоксанов, простациклинов и других активных метаболитов. Наблюдались также гормональные влияния на Na+, К+-зависимую АТФазу, связанную с мембраной протеинкиназу и катехол- О-метилтрансферазу. Таким образом, на уровне плазматической мембраны гормоны индуцируют множество процессов, участвующих в интегрированных реакциях клетокмишеней на активацию рецепторов гомологичным лигандом.

ХАРАКТЕРИСТИКА РЕЦЕПТОРОВ ПЕПТИДНЫХ ГОРМОНОВ

Исследования по связыванию, проводимые с помощью меченных радиоактивными атомами гормонов, позволили выявить некоторые характерные особенности, свойственные рецепторам многих пептидных гормонов. Универсальной чертой рецепторов является их способность распознавать и связывать соответствующие химические передатчики или гормоны в присутствии избытка молекул других видов. Это свойство легко проявляется в присутствии меченого гормона как избирательная реакция связывания с высоким сродством, которая приводит к образованию специфического гормонрецепторпого комплекса. За последние несколько лет такие взаимодействия наблюдались во многих гормончувствительных тканях. Во многих исследованиях наличие специфических связывающих мест в соответствующих тканях-мишенях принимали за доказательство присутствия гормональных рецепторов. Специфические связывающие места обнаружены также в клетках, которые не принято считать клетками-мишенями, например рецепторы инсулина и СТГ в лимфоцитах, рецепторы пролактина в печени и надпочечниках. Если учитывать, что правильное представление о рецепторах предполагает присутствие не только распознающего, но и запускающего реакцию компонента, то под такое определение не подходят рецепторы, для которых функциональная реакция пока остается не выясненной, а также рецепторы, которые выделены, солюбилизированы или расположены на нереагирующих клеточных компонентах. Таким образом, рецептор характеризуется специфическим связыванием лиганда и способностью передавать регуляторный сигнал, если даже дистальные элементы реакции отсутствуют или неидентифицированы.

Наиболее полное представление о рецепторе пептидного гормона включает двоякие функциональные свойства: поверхностное распознавание и трансляцию гормонрецепторного взаимодействия в специфическую биологическую реакцию. Независимо от того, является ли клеточной реакцией секреция пептидов, стероидогенез, сокращение или транспорт ионов, механизмы, опосредующие гормональный эффект, обычно включают изменение кальциевых потоков и метаболизма циклических нуклеотидов. На мембранных фракциях или интактных клетках многих тканей-мишеней наблюдали зависимость между связыванием гормона и биохимическими реакциями. Корреляция между насыщенностью рецепторов и активностью аденилатциклазы продемонстрирована на препаратах мембран многих гормончувствительных клеток, например клеток надпочечника в случае действия АКТГ, печени в случае действия глюкагона, почек при добавлении вазопрессина, эритроцитов птиц под влиянием катехоламинов, семенных канальцев в присутствии ФСГ, а также семенников и яичников в присутствии ЛГ и ХГЧ. В интактных тканях и изолированных клетках-мишенях связывание гормона также кор-

релировало с синтезом и высвобождением цАМФ [6]. Корреляцию связывания гормона с последующими клеточными реакциями наблюдали в отношении инсулина и окисления глюкозы в жировых клетках или транспорта аминокислот в тимоцитах, катехоламинов и транспорта натрия в эритроцитах,. ЛГ и продукции андрогенов семенниками, а также ангиотензина II и продукции альдостерона клетками клубочковой зоны надпочечника.

Иногда полагают, что гормональными рецепторами следует называть только те связывающие места ткани, которые можно отождествить с определенной биохимической реакцией. Однако» специфическое связывание меченых лигандов при условии соблюдения адекватных требований к методике его определения все-же является веским указанием на присутствие гормональных рецепторов. К таким требованиям относятся использование меченого гормона с отчетливой биологической активностью (полученного с помощью монойодирования или тритирования), точная оценка неспецифического связывания и исключение связывания с разрушающими или другими ферментативными активностями, присутствующими в тканевых фракциях. Большинство рецепторов пептидных гормонов проявляет высокую специфичность по отношению к биологически активным гормонам или их производным,, высокое сродство связывания, характеризующееся константами; равновесия ассоциации порядка 109—1011 М~1, и насыщаемость при относительно низких концентрациях гормона. Последние свойства соответствуют низкой концентрации гормональных рецепторов в ткани-мишени, которая составляет обычно всего несколько» тысяч мест на клетку. Реакция связывания всегда зависит от температуры, отличается высокой скоростью и в бесклеточных препаратах обычно обратима. В интактных клетках недавно был обнаружен необратимый компонент связывания гормона, и для тромбина и фактора роста эпидермиса (ФРЭ) было показано ковалентное присоединение лиганда к рецептору. Точное определение констант связывания и термодинамических свойств рецепторов часто затрудняется тем, что в опытах по связыванию, проводимых in vitro при физиологических температурах, может иметь место деградация гормона и рецептора. В условиях же, свойственных экспериментам in vivo, также трудно изучать кинетические и связывающие свойства рецепторов гормонов. На скорость ассоциации и диссоциации гормона большое влияние оказывает температура, а кругооборот молекул гормона в местах рецепции при характерных для организма условиях температуры и перфузии изучен недостаточно.

Белковая природа рецепторов полипептидных гормонов на плазматической мембране доказывается их расщеплением под действием различных протеолитических ферментов и пептидаз. На многие рецепторы влияет также фосфолипаза, что указывает на содержание в них важного фосфолипидного компонента или на роль ассоциации с фосфолипидной структурой мембраны в проявлении связывающей активности. Сообщалось, что некоторые рецепторы (для инсулина, ЛГ и ТТГ) содержат углеводные компоненты, иногда влияющие на связывающую активность. Отдельные рецепторы, такие, как рецепторы ЛГ, ФСГ и пролактина, для сохранения своей биологически активной конформации требуют присутствия дисульфидных групп.

Физико-химическая характеристика рецепторов пептидных гормонов затрудняется в результате их относительной нерастворимости, что свойственно многим белкам, содержащимся в мембране. В нескольких тканях из клеток и клеточных частиц удалось выделить рецепторы с помощью ограниченного ферментативного расщепления или инкубации в условиях, способствующих высвобождению поверхностных белков. Однако растворимые гормональные рецепторы для физико-химического анализа получают обычно путем экстрагирования из мембранных фракций и гомогенатов с помощью неионных детергентов, таких, как тритон Х-100 и люброл. Растворение плазматических мембран детергентами обычно приводит к утрате функционального сопряжения между гормонсвязывающими местами и ассоциированными с мембраной активностями, такими, как аденилатциклаза. Однако после удаления детергента наблюдается частичное восстановление гормонстимулируемой активности аденилатциклазы, а иногда после экстрагирования из тканевых фракций неионными детергентами солюбилизированная аденилатциклаза сохраняет чувствительность к гормону. В настоящее время из клеточных мембран экстрагированы специфические места связывания ацетилхолина, ангиотензина II, инсулина, глюкагона, ЛГ — ХГЧ, ФСГ, пролактина и» гормона роста [8].

Переформированные гормонрецепторные комплексы, образуемые путем насыщения тканей-мишеней меченым гормоном, можно легко экстрагировать с помощью обработки неионными детергентами. Такие гормонрецепторные комплексы обычно более стабильны в растворе, чем свободные, или «ненагруженные» рецепторы, и создают некоторые преимущества для физической характеристики. Яичниковые рецепторы ЛГ, предвари-

тельно меченные in vivo путем инъекции радиоактивного гонадотропина, обладают теми же самыми физическими свойствами, что и гормонрецепторные комплексы, образуемые путем метки нерастворимых фракций in vitro до солюбилизации. Некоторые свободные рецепторы и гормонрецепторные комплексы анализировали с помощью гельфильтрации и центрифугирования в градиенте плотности, и их молекулярная масса колебалась от 150 000 до 400 000.

Большинство солюбилизированных детергентом рецепторов при физическом анализе обнаруживают свойства молекул удлиненной формы с относительно большими для их констант седиментации (6,5—9,08) гидродинамическими радиусами в 6—7 нм. Эти свойства во многом обусловлены гликопротеиновой природой и выраженной асимметрией рецепторной молекулы, но отчасти могли бы объясняться и связыванием детергента с солюбилизированным белком. Очистку солюбилизированных детергентом гормональных рецепторов производили с помощью соответствующих методик фракционирования, а также аффинной хроматографии на гель-лигандных комплексах. Обычно такая очистка ограничена; главное исключение составляет холинергический рецепторный белок из ткани электрических органов некоторых рыб. С помощью аффинной хроматографии очищали также изолированные рецепторы инсулина, ЛГ — ХГЧ и пролактина. Хотя выход был весьма небольшим, но очищенные рецепторы оказались относительно стабильными и сохраняли высокое сродство и специфичность связывания гормональных лигандов. Этим методом тестикулярные рецепторы ЛГ были очищены примерно в 15000 раз, т. е. до 50% гомогенности белка. Наиболее высоко очищенный препарат рецептора ЛГ мигрирует при SDS-гель-электрофорезе в виде одного-компонента с молекулярной массой около 90 000, что свидетельствует о том, что экстрагированный детергентом рецептор представляет собой димер, состоящий из двух близких субъединиц [6]. Рецепторы пролактина и СТГ из ткани молочной железы и печени также были очищены с помощью аффинной хроматографии, причем было показано, что антитела, полученные к очищенным рецепторам пролактина, ингибируют биологическое действие этого гормона на его ткани-мишени [9]. Для анализа структурных особенностей, определяющих связывание гормона и активацию ассоциированных с мембраной ферментных систем, которые опосредуют его действие, необходима очистка больших количеств рецепторных мест.

Рис. 4—3. «Плавающий рецептор»—двухстепенная физическая модель взаимодействия пептидного гормона с рецептором и активации аденилатциклазы в клеточной мембране.

РЕЦЕПТОРЫ ПЕПТИДНЫХ ГОРМОНОВ И КОМПОНЕНТЫ МЕМБРАНЫ

Хотя термин «рецептор» удобен для описания связывающих компонентов мембраны, с которыми взаимодействует гормон, использование его означает отсутствие сведений о специфических химических структурах, участвующих в реакции связывания. Если взаимодействующий участок вещества или лиганда известен, то точнее было бы при описании использовать его структуру, а не термин «рецептор». Рецепторы можно характеризовать по их специфической «узнающей» и связывающей функциям или, более широко, по тем изменениям, которые приводят к развертыванию специфической биологической реакции. Для объяснения механизмов, с помощью которых связывание с рецептором приводит к модификации мембранных ферментов, предложено несколько гипотез. На смену первоначальной точке зрения, согласно которой гормональные рецепторы структурно объединены с аденилатциклазой и играют роль регуляторной

субъединицы фермента, пришли другие, точнее соответствующие данным о жидкой природе клеточных мембран.

Гипотеза мобильного рецептора, предложенная для объяснения механизма модуляции аденилатциклазы в клеточной мембране гормонрецепторным взаимодействием [10], основана на предположении, что рецепторные и ферментные белки представляют собой отдельные и разные молекулы (рис. 4—3). Считают, что связывание гормона с рецептором повышает сродство последнего к другим мембранным компонентам, участвующим в активации аденилатциклазы. Такая двухстепенная модель гормонрецепторного взаимодействия с аденилатциклазой согласуется с возможностью латеральной диффузии молекул рецепторов и фермента в жидком матриксе плазматической мембраны. Она объясняет также отсутствие аддитивности в активации аденилатциклазы многочисленными гормонами в определенных клетках и модуляцию независимых мембранных процессов одним гормоном, если предположить, что его комплекс с рецептором обладает сродством не к одной, а к нескольким регуляторным молекулам. Мобильность гормональных рецепторов в жидком матриксе мембраны могла бы также иметь значение для активации аденилатциклазы в эпителиальных клетках, обладающих морфологической полярностью, например в кишечнике, почках, печени и мочевом пузыре. Наконец, конкурентные антагонисты пептидных гормонов представляются молекулами, сохраняющими сродство связывания с рецепторами, но лишенные способности вызывать изменения конформации и реактивности последних, необходимые для активации аденилатциклазы.

Хотя рецепторные места для гормонов, по-видимому, физически отделены от аденилатциклазы, эти две молекулы обладают очевидной тесной функциональной связью, подтверждающей предположения о рецепторе как о регуляторном участке аденилатциклазного комплекса. В некоторых тканях соответствие между концентрацией гормональных рецепторов и активностью аденилатциклазы свидетельствует о существовании тесно связанного рецепторциклазного комплекса в мембранах клетокмишеней. Зависимость гормональной активации аденилатциклазы от фосфо-липидов, наблюдаемая в некоторых мембранных и солюбилизированных препаратах, указывает на необходимость сопрягающего компонента липидной природы для ассоциации этих двух активностей. Изучение взаимоотношений между специфическими гормональными рецепторами и активностью аденилатциклазы в разных физиологических условиях и на разных стадиях развития также выявило тесную корреляцию между обоими параметрами. Так, появление рецепторов гонадотропина в семенниках плода тесно связано с приобретением клетками способности реагировать изменением уровня цАМФ на стимуляцию ЛГ и способности синтезировать тестостерон [11]. Более того, десенситизация кле- ток-мишеней путем воздействия агонистов часто сопровождается одновременной утратой гормончувствительной аденилатциклазы ц гормональных рецепторов. Опыты с десенситизацией обнаружили также уменьшение общей активности имеющейся аденилатциклазы, что указывает на инактивацию значительной части аденилатциклазы при насыщении рецепторов гормонами. Такие временные и количественные корреляции между двумя активностями подчеркивают тесную физическую связь рецепторов пептидных гормонов с аденилатциклазой в клеточной мембране.

Более современные модели пытаются учитывать функциональную сложность аденилатциклазной системы, содержащей не менее трех участков, с которыми реагируют отдельные лиганды, изменяя активность фермента. К ним относятся участок, взаимодействующий с гормоном, каталитический или ферментативный участок, реагирующий с Mg-АТФ, и промежуточный регуляторный участок, взаимодействующий преимущественно с гуаниловыми нуклеотидами. Изучение влияния гуаниловых нуклеотидов на активацию печеночной аденилатциклазы глюкагоном показало, что аденилатциклазный комплекс существует в различных формах, которые могут переходить друг в друга при согласованном действии гормона и гуанилового нуклеотида [12]. После этого аналогичные эффекты ГТФ наблюдали на многих гормончувствительных тканях. Синтетические аналоги ГТФ, устойчивые к ферментативному гидролизу, также стимулируют большинство аденилатциклазных систем, что указывает на роль гуаниловых нуклеотидов в качестве аллостерических активаторов аденилатциклазы. Один из таких аналогов Gpp (NH) p активирует аденилатциклазу, взаимодействуя с тем же самым участком, с которым реагирует и ГТФ. В некоторых тканях связывание меченого Gpp (NH) p с клеточными мембранами коррелирует со степенью активации аденилатциклазы. Сочетанное воздействие гормона и-Gpp (NH) p вызывает длительную активацию аденилатциклазы,. причем в очень многих тканях животных Gpp (NH) p повышает как исходную, так и стимулированную гормоном активность этого фермента. Такие эффекты ГТФ и его аналогов свидетельствуют о том, что регуляция взаимодействия между нуклеотидами и ка-

Эти наблюдения свидетельствуют о том, что молекулы как инсулина, так и глюкагона в процессе отложения в гранулах ассоциируются с помощью своих гидрофобных участков; связывание их с рецепторами также определяется преимущественно гидрофобными взаимодействиями. Существование двух гидрофобных участков, впервые обнаруженное в мономере глюкагона, было отмечено и в молекулах секретина и вазоактивного интестинального пептида. Некоторые меньшие по размерам молекулы, такие, как тиротропин-рилизинг гормон, рилизинг-гормон лютеинизирующего гормона, ангиотензин II и брадикинин, также обладают двойной симметрией. Это позволило предположить, что симметричные свойства пептидных последовательностей отражаются в структуре рецепторов и что такие пептиды связываются с двумя сходными или идентичными субъединицами рецептора. Две субъединицы недавно были обнаружены в рецепторах ЛГ, инсулина и ангиотензина II, тогда как рецептор ацетилхолина состоит из нескольких субъединиц. Такая состоящая из субъединиц структура гормональных рецепторов могла бы отражать их общее свойство, связанное с эволюцией симметрии и внутренней гомологии пептидных гормонов, равно как и с возникновением кооперативных взаимодействий при контакте с рецепторами.

Процессы, обусловливающие окончание гормонрецепторного взаимодействия in vivo, выяснены недостаточно. Хотя реакция связывания может, конечно, быть обратимой, но, в соответствии с законом действия масс, механизм, определяющий продолжительность активации рецептора в интактной клетке, по-видимому, отличается от простой диссоциации. Можно было бы предположить разрушение высвобождающегося из комплекса с рецептором гормона, но разрушение большинства гормонов изолированными клетками-мишенями не зависит от взаимодействия с рецепторами. Кроме того, гормон, который специфически связывается тканями-мишенями, после элюции с рецепторов полностью сохраняет свою биологическую активность. Это свойство можно использовать для очистки радиоактивных гормонов с помощью аффинной хроматографии на осажденных рецепторах, чтобы выделить биологически активные молекулы из меченых гормональных препаратов. Как будет показано далее, часть гормон-рецепторных комплексов инактивируется или разрушается в живых клетках в ходе процессов, включающих интернализацию и лизосомный катаболизм.

НАСЫЩЕННОСТЬ РЕЦЕПТОРОВ И АКТИВАЦИЯ РЕАКЦИЙ КЛЕТОК-МИШЕНЕЙ

Большинство исследований, посвященных результатам гормонрецепторных взаимодействий, свидетельствуют о том, что активация аденилатциклазы и реакций кле- ток-мишеней является функцией насыщенности рецепторов. Во многих тканях, однако, сродство связывания рецепторов оказывается меньшим, чем концентрация гормона требуемая для развития полумаксимальной биологической реакции, а полная биологическая реакция называется насыщением небольшой части имеющихся рецепторов. Даже в тех случаях, когда все большее насыщение рецепторов сопровождается ростом реакций в широких пределах связывания гормона, степень реакции обычно непропорциональна числу занятых рецепторов. Кроме того, известно, что многие гормоны способны стимулировать продукцию гораздо большего количества цАМФ, чем это необходимо для индукции максимальной биологической реакции в клетке-мишени. Такие наблюдения привели к выводу, что многие гормончувствительные ткани характеризуются «запасом» или «избытком» рецепторов, или «рецепторным резервом», что аналогично ситуации, описанной Stephenson при изучении тканей, чувствительных к лекарственным веществам [14]. Несомненно, что такие рецепторные участки клетки не являются лишними; предполагают, что они играют роль резервуара поверхностных рецепторов, обеспечивающего возможность повышения чувствительности клеток-мишеней к активирующему влиянию низких концентраций гормона. Таким образом, высокая плотность поверхностных рецепторов могла бы способствовать быстрой ассоциации и достижению критических или пороговых уровней насыщенности, обусловливающих активацию клет- ки-мишени.