14. Методы генетической идентификации (пцр, мг).

Основой ДНК технологий является молекулярная гибридизация — специфическое взаимодействие комплементарных цепей нуклеиновых кислот. В основе гибридизации лежит способность ДНК к саморепликации. Двухцепочечная ДНК разделяется на две нити при нагревании до 95-100ºС. При понижении температуры происходит гибридизация ДНК с образованием двухцепочечной структуры. Для диагностической гибридизации используют не всю ДНК, а лишь ее участок, специфический фрагмент, который обнаруживают с помощью искусственно созданного зонда, обладающего комплементарностью.

Гибридизация возможна не только между ДНК-ДНК, но и ДНК-РНК, РНК-РНК. В настоящее время для гибридизации часто используется 16S рибосомальная РНК, которая отличается у разных видов микроорганизмов и представлена тысячами идентичных копий в каждой клетке. Для проведения гибридизации не требуется выделение чистой культуры возбудителя, а процесс идентификации занимает 6-48 часов.

Гибридизация проводится в несколько этапов: 1) обработка исследуемого материала с целью разрушения исследуемого микроорганизма, высвобождение ДНК и ее последующая денатурация; 2) внесение диагностического меченого зонда; 3) детекция и интерпретация полученных результатов.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического фрагмента ДНК, катализируемое ферментом ДНК- полимеразой. Естественная репликация ДНК включает в себя несколько стадий: 1) денатурация ДНК (расплетение двойной спирали); 2) образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок); 3) комплементарное достраивание обеих нитей.

При многократном повторении циклов синтеза количество специфических фрагментов ДНК растёт в геометрической прогрессии. Комплементарное достраивание цепи начинается только в определенных стартовых блоках — коротких двунитевых участках между двумя праймерами.

Методика проведения анализа с использованием метода ПЦР включает три этапа: 1) выделение ДНК (РНК) из клинического образца; 2) амплификация специфических фрагментов ДНК; 3) детекция продуктов амплификации.

При выделении клиническая проба подвергается обработке, в результате которой происходит лизис клеточного материала, удаление белковых и полисахаридных фракций, и получение раствора ДНК или РНК, свободного от ингибиторов и готового для дальнейшей амплификации

При амплификации происходит накопление коротких специфических фрагментов ДНК.

Каждый цикл амплификации включает три этапа:

1 этап: Денатурация ДНК. Протекает при 93-95^о в течение 30-40 сек.

2 этап: Присоединение праймеров (отжиг). Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65^оС. Время отжига 20-60 сек.

3 этап: Достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5’-конца к 3’-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (дНТФ). Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой) и проходит при температуре 70-72^оС. Время протекания синтеза 20-40 сек

Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). Происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2ⁿ. За 30-40 циклов накапливается 10⁸ ампликонов из одной бактерии. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле.

На этапе детекции проводится разделение смеси продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. До проведения электрофоретического разделения, к амплификационной смеси добавляется раствор бромистого этидия, образующий с двухцепочечными фрагментами ДНК прочные соединения внедрения. Эти соединения под действием УФ-облучения способны флуоресцировать, что регистрируется в виде оранжево-красных светящихся полос.

ПЦР имеет ряд преимуществ для диагностики инфекционных заболеваний:

1. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.

2. Высокая специфичность.

3. Высокая чувствительность. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов.

4. Высокая скорость получения результата анализа. 4-4,5 часа.

5. Возможность качественного и количественного выявления в одной пробе сразу нескольких возбудителей.

6. Возможность видовой и даже внутривидовой дифференциации.

7. Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций.

Недостатки:

1. ПЦР сложный и многоэтапный метод, требует специально подготовленного персонала.

2. При постановке ПЦР существует риск получения ложноположительных результатов (случайно искомый ДНК попадает в исследуемый материал).

3. Существует сложность при дифференциации живого и погибшего возбудителя.

15. Генная инженерия и биотехнология.

Биотехнология — это получение продуктов из биологических объектов или с применением биологических объектов.

В качестве биологических объектов могут быть использованы организмы животных и человека.

Однако в качестве биологических объектов чаще используют одноклеточные микроорганизмы, а также животные и растительные клетки по следующим причинам:

1. Клетки являются своего рода «биофабриками», вырабатывающими в процессе жизнедеятельности разнообразные ценные продукты.

2. Клетки быстро воспроизводятся, биомасса быстро наращивается.

3. Биосинтез сложных веществ значительно экономичнее и технологически доступнее, чем химический синтез.

4. Возможность проведения биотехнологического процесса в промышленных масштабах.

Обычно продукты жизнедеятельности одноклеточных делят на 4 категории:

• Сами клетки как источник целевого продукта. Например, выращенные бактерии или вирусы используют для получения живой или убитой корпускулярной вакцины;

• Крупные молекулы (макромолекулы), которые синтезируются клетками в процессе выращивания: ферменты, токсины, антигены, антитела;

• Первичные метаболиты — низкомолекулярные вещества, необходимые для роста клеток (аминокислоты, витамины);

• Вторичные метаболиты— низкомолекулярные соединения, не требующиеся для роста клеток (антибиотики, алкалоиды).

Промышленное производство в биотехнологии по сути основано на нескольких принципах: брожении (ферментация), биоконверсии (превращение одного вещества в другое).

Практическое применение нашли не более 100 видов микроорганизмов (бактерии, грибы, дрожжи, вирусы, водоросли).

Среди бактерий применяют следующие микроорганизмы: Bacillus — для получения ферментов, средств защиты растений; Clostridium — для сбраживания сахаров в ацетон, этанол, бутанол; молочнокислые бактерии.

Многие микроорганизмы используют в качестве реципиентов чужеродного генетического материала с целью получения рекомбинантных. Получены рекомбинантные штаммы E.coli, продуцирующие интерфероны, инсулин.

Для получения вакцин и диагностических препаратов используют также патогенные микроорганизмы (брюшного тифа, коклюша).

Основным условием для успешного проведения технологического процесса является выбор или получение высокопродуктивного штамма-продуцента и поддержание его в активном состоянии.

Вторым важным условием является выбор питательных сред. Они должны быть достаточно дешевы и доступны в использовании. Биотехнологический процесс ведется в асептических условиях, в автоматическом режиме, с программным обеспечением.

Генная инженерия — направление биотехнологии, позволяющее целенаправленно изменять наследственный материал живых существ.

Установили, что бактерии пытаются защитить себя от действия бактериофагов: с помощью ферментов-рестриктаз они разрезают ДНК вирусов, проникших в бактерию, на фрагменты и делают вирус неактивным. Действие рестриктаз высокоспецифично: они разрезают ДНК в строго определенных местах по одним и тем же основаниям. При этом неровном разрезе возникают два выступающих конца, которые притягиваются друг к другу благодаря наличию водородных мостиков. Поэтому их называют «липкими» концами. Другой фермент — ДНК-лигаза — может, расходуя АТФ, легко вновь соединить липкие концы.

Если с помощью рестриктаз вырезать фрагменты ДНК из разных организмов, то они будут иметь подходящие друг к другу липкие концы, которые в присутствии ДНК-лигазы можно легко соединить.

В качестве векторов для переноса генов в генной инженерии используют плазмиды и бактериофаги.

Метод клонирования заключается в том, что выделенный ген вводится в состав вектора. Затем вектор переносится в быстро размножающуюся, неприхотливую бактерию-хозяина для репликации. Путем клонирования любой фрагмент ДНК может быть размножен в бактериях в миллиарды раз, а потом с помощью рестриктаз снова выделен.

Цели генной инженерии:

- модификация естественных генов человека, животных;

- синтез новых генов и изучение закономерности экспрессии генов;

- получение генно-инженерных продуктов и использование их в клинической практике.

Используемые технологии:

1. Создание трансгенных организмов с заданными свойствами.

2. Гибридизация клеток и получение моноклональных антител, отличающихся высокой специфичностью действия.

3. Использование рекомбинантных микроорганизмов

Основные направления медицинской биотехнологии:

1. Генная инженерия

2. Клеточная инженерия (гибридизация и реконструкция клеток)

3. Культивирование микроорганизмов

4. Иммобилизация ферментов, лекарств