• Световая микроскопия. В микроскопах используют источники света с разными длинами волн. В обычных световых микроскопах источниками света служат естественный или искусственный свет. Минимальная длина волны видимой части спектра равна 0,4 мкм. Поэтому для светового микроскопа наименьшее разрешаемое расстояние равно 0,2 мкм, а общее увеличение составляет 1500-2400 раз. Таким образом, в световом микроскопе можно увидеть не только отдельные клетки размером от 4 до 150 мкм, но и их внутриклеточные составляющие- органеллы и включения. Для усиления контрастности микрообъектов используют окрашивание.

• УФ-микроскопия (ультрафиолетовая). Это разновидность световой микроскопии. В ультрафиолетовом микроскопе используют более короткие ультрафиолетовые лучи с длиной волны 0,2 мкм. Разрешаемое расстояние здесь в 2 раза меньше, чем в световых микроскопах, и составляет около 0,1 мкм. Полученное в ультрафиолетовом спектре невидимое для глаза изображение переводят в видимое с помощью специальных устройств, например, люминесцентного экрана.

• Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия. В флюоресцентных микроскопах для возбуждения флюоресценции в качестве источников света применяют ртутные или ксеноновые лампы сверхвысокого давления, обладающие высокой яркостью в области спектра 0,25-0,4 мкм. Длина световой волны флюоресценции всегда больше длины волны возбуждающего света, поэтому их разделяют с помощью светофильтров. Различают первичную и вторичную флюоресценцию. Первичная флюоресценция характерна, например, для серотонина, адреналина и норадреналина. Вторичная флюоресценция возникает при использовании специальных средств- флюорохромов различной химической природы.

• Фазово-контрастная микроскопия. Этот вид микроскопии используют для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных живых объектов, невидимых при обычных методах микроскопирования. Метод фазового контраста обеспечивает контрастность изучаемых неокрашенных структур за счёт специальной кольцевой диафрагмы, помещаемой в конденсоре, и фазовой пластинки, находящейся в объективе. Такая конструкция оптики позволяет преобразовать не воспринимаемый глазом фазовые изменения прошедшего через неокрашенный препарат света в изменение его амплитуды, т.е. яркости получаемого изображения. Повышение контраста позволяет видеть все структуры, различаются по показателю преломления.

• Микроскопия в тёмном поле. В микроскопе имеется конденсор, который освещает препарат строго косым светом, лучи от осветителя направляются сбоку. Поле выглядит тёмным, а мелкие частицы в препарате отражают свет. Этот метод используют для изучения живых объектов, авторадиографических объектов. В клинике используют, например, для изучения кристаллов мочевой кислоты в моче и изучения treponema palladium, вызывающий сифилис и др.

• Интерференционная микроскопия. В интерференционном микроскопе пучок света от осветителя разделяются на 2 потока: один проходит через объект и изменяет его по фазе колебания, второй идёт, минуя объект. В объективе оба пучка соединяются и интерферируют. В результате строится изображение, в котором участки микрообъекта разной толщины и плотности различаются по степени контрастности.

• Именно фазово-контрастная и интерференционная микроскопии позволяют изучать живые клетки, используя эффект интерференции! Также они позволяют видеть клетки в процессе движения и даже митоза!

• Поляризационная микроскопия. В поляризационном микроскопе появляются два поляризационных фильтра- первый (поляризатор) между пучком света и объективом, а второй (анализатор)- между линзой объектива и глазом. Через первый фильтр свет проходит только в одном направлении, второй фильтр имеет главную ось, которая расположена перпендикулярно первому фильтру, и он не пропускает свет. Получается эффект тёмного поля. Если анализатор повернуть на 90 градусов по отношению к поляризатору, то свет проходить не будет; если оси будут совпадать, то свет проходить будет. Используется для изучения, например, коллагена, микротрубочек, микрофиламентов, кристаллических структур клеток Лейдига (гранулоциты яичка) и др.

• Электронная микроскопия. В электронном микроскопе используется поток электронов с более короткими, чем у света, длинами волн. Длина волны электронов в вакууме составляет 0,0056 нм. Поэтому разрешаемое расстояние будет около 0,002 нм. В современных электронных микроскопах разрешаемое расстояние равно 0,1- 0,7 нм. Трансмиссионный электронный микроскоп используют для получения плоскостного изображения препарата, а растровые электронные микроскопы используют для создания трехмерного изображения.

Методы исследования фиксированных клеток и тканей

Основным объектом исследования являются гистологические препараты. Их готовят в 5 стадий:

• Взятие материала и его фиксация, которая обеспечивает предотвращение процессов разложения, что способствует сохранению целостности структур. Для фиксации используют спирт, формальдегид, осмиевую кислоту и др.

• Уплотнение кусочков, необходимо для приготовления среза, проводится путем пропитывания органическими смолами или углекислотой

• Приготовление срезов

• Окраска срезов для световой микроскопии или напылением их солями металлов для электронной микроскопии. Избирательство структур к определённым красителям обусловлено их химическим составом и физическими свойствами.

• Для световой микроскопии есть ещё один этап- заключение срезов в бальзам для более длительного сохранения.

Методы исследования живых клеток и тканей

Позволяют получить наиболее полноценную информацию про клетку- проследить движение, процессы деления, роста и развития, дифференцировки и взаимодействия клеток и др.

Одним из методов является исследование и наблюдение структур в живом организме с помощью просвечивающих микроскопов-иллюминаторов. Таким образом, например, изучают циркуляцию крови в микрососудах.

Трансплантация, например, клеток костного мозга от здоровых животных-доноров к животному-реципиенту, подвергнутому смертельной дозой облучения, показало образование новой колонии кроветворных клеток в селезенке.

Витальное (прижизненное) окрашивание используют, например, для исследования межклеточного вещества (в частности, чёрных клеток жировых отложений в печени). Краситель вводят в организм животного, и при этом он избирательно окрашивает определённые клетки или межклеточное вещество.

Исследование живых клеток в культуре. Выделенные из живого организма клетки, маленькие образцы тканей или органов помещают в стеклянные сосуды, содержащие питательных среду. Так исследуют, например, плазму крови, эмбриональный экстракт. Также с помощью этого метода была показана возможность хрящевых клеток формировать в культуре межклеточное вещество и способность клеток надпочечников продуцировать гормоны.

Гибридизация. Клонирование гибридных клеток используют для образования гибридных клеточных линий, которые используются для изучения генома. Так установили роль 11 хромосомы в участии синтеза инсулина. Также клеточные линии используют для получения антител. Антитела можно использовать, например, для изучения функции различных молекул, вводя их в цитоплазму клетки.