Практика 7. Принципы культивирования бактерий.

• Наличие полноценной питательной среды.

• Температуру культивирования, которая влияет на скорость размножения.

По отношению к температуре роста бактерии разделяют на три основные группы - психрофилы, мезофилы и термофилы.

— Психрофилы живут и размножаются при пониженных температурах (от - 10 до 20 °С).

— Мезофилы включают бактерии, температурный диапазон роста которых находится между 10 и 45 °С. Оптимальная температура для их культивирования - 25-37 °С.

— Термофилы способны расти при повышенных температурах (42-50 °С). Для поддержания требуемой температуры используют специальные приборы - термостаты.

• Атмосферу культивирования.

— Для роста и размножения строгих аэробов необходим кислород. Аэробы хорошо растут на поверхности агара на чашках Петри или в тонком верхнем слое жидкой среды. Факультативные анаэробы культивируют в аналогичных условиях.

— Микроаэрофилы, нуждающиеся в пониженной концентрации кислорода, культивируют в атмосфере 5% СО2 в специальных СО2-инкубаторах либо посевы помещают в эксикаторы, в которых устанавливают горящую свечу.

— Облигатные анаэробы для своего роста и размножения требуют исключения доступа кислорода воздуха.

• Время культивирования зависит от времени генерации. Большинство бактерий культивируют для получения видимого роста в течение 18-48 ч. Для ряда бактерий требуются более длительные сроки культивирования.

• Освещение. Для выращивания фототрофных микроорганизмов необходим свет. Некоторые условно-патогенные микобактерии в зависимости от освещенности образуют пигмент, что используют при их идентификации.

• Условия, исключающие попадание других видов бактерий: использование стерильной посуды и стерильных питательных сред

8. Особенности культивирования анаэробов.

Для культивирования анаэробных микроорганизмов необходимо создать бескислородные условия. Этого достигают несколькими методами:

1. Физические методы основаны на создании вакуума в специальных аппаратах - анаэростатах.

• Анаэростат представляет собой металлический толстостенный цилиндр с хорошо притертой крышкой, снабженной отводным краном и монометром. После помещения в цилиндр засеянных чашек или пробирок крышку плотно закрывают и удаляют воздух с помощью вакуумного насоса (иногда воздух заменяют каким-либо другим газом, например СО2).

• Посев материала в высокий столбик плотной или полужидкой питательной среды.

• Регенерация путем кипячения.

• Эвакуацинно-заместительный способ заключается в удалении воздуха из герметически закрытых сосудов (анаэростатов, анаэробных боксов) при помощи вакуумного насоса с последующей заменой его инертным газом (азот, аргон, гелий) или бескислородной газовой смесью, состоящей из 80% азота, 10% двуокиси углерода и 10% водорода.

2. Химические методы заключаются в том, что при культивировании на жидких питательных средах в них добавляют редуцирующие кислород вещества - аскорбиновую или тиогликолевую кислоту.

• В случае культивирования анаэробных бактерий на плотных питательных средах посевы помещают в герметически закрытые емкости, в которые вносят поглотители кислорода, например пирогаллол или гидросульфит натрия.

• Применение газогенерирующих систем. Система Gas Pak состоит из двух основных компонентов: герметично закрывающегося пластикового контейнера GasPak с прозрачными стенками и газорегенерирующих пакетов одноразового применения. При вынимании этих пакетов из упаковки происходит их активация, в результате которой создаются анаэробные условия.

• Создание среды Вильсон – Блера. (железо-сульфитный агар). Clostridium spp. растут в глубине столбика этой среды, давая колонии чёрного цвета за счёт восстановления сернокислого натрия в сульфат натрия, который, соединяясь с хлорным железом, образует чёрный осадок сернистого железа.

3. Биологический метод (метод Фортнера) Биологический метод основан на одновременном культивировании строгих аэробов и анаэробов на плотной среде в чашках Петри, которые герметически закупоривают. Вначале кислород поглощается строгим аэробом, растущим на одной половине чашки, а затем начинается рост анаэробов, материал на которые посеян на другой половине чашки.

• Добавление в питательную среду кусочков внутренних органов (среда Китта – Тароцци); Тиогликолевая среда - универсальная среда для накопления анаэробных бактерий. Для этих целей можно использовать среду Китта-Тароцци, которая состоит из сахарного бульона, налитого в количестве 10 мл в пробирку; на ее дно помещают кусочек вареных паренхиматозных органов (печени), который связывает растворенный в среде кислород, адсорбируя его на себе.

4. Механические;

• Посев уколом в столбик сахарного агара; Аэробы растут только в верхней части укола; анаэробы, наоборот, - только в нижней; факультативные анаэробы - по всему уколу.

• Метод Виньял-Вейона; В пробирку с 0,5% расплавленным и охлажденным до температуры 40-45°С сахарным агаром вносят пипеткой небольшое количество исследуемого материала и тщательно размешивают. Затем содержимым пробирки заполняют капилляры трех пастеровских пипеток. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2-3 суток в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов.

• Метод Перетца. Готовят разведения исследуемого материала в 0,5% расплавленном агаре. Содержимое пробирки выливают в стерильную чашку Петри, на дне которой на двух стеклянных или деревянных палочках располагается стеклянная пластинка размером 6x6 см. Среду заливают сбоку таким образом, чтобы она заполнила пространство между пластинкой и дном чашки Петри.

Наиболее простой и удобной разновидностью метода Перетца является метод “перевернутых чашек”. При этом каждое разведение исследуемого материала в пробирке с сахарным агаром заливают в крышку чашки Петри и закрывают ее стерильным донышком чашки, избегая образования пузырей воздуха. Щель между краями крышки и дном чашки Петри заливают расплавленным парафином и термостатируют при 37°С до появления изолированных колоний анаэробов.

5. Смешанные.