11. Характеристика второго этапа бактериологического метода диагностики. Колонии бактерий, критерии их оценки.

Засеянные чашки вынимают из термостата и изучают выросшие на питательной среде колонии. Вначале проводят описание характера роста колоний на питательной среде, т.е. их культуральные свойства.

Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете. Чашку поворачивают дном к себе и рассматривают колонии в проходящем свете. При наличии различных видов колоний их нумеруют и описывают каждую в отдельности.

Обращают внимание на следующие свойства:

а) величину колоний (крупные — более 4 мм в диаметре, средние — 2 — 4 мм, мелкие — 1 — 2 мм, карликовые — менее 1 мм);

б) форму очертаний колоний (правильно и неправильно округлая, розеткообразная, ризоидная и др.);

в) степень прозрачности (непрозрачная, полупрозрачная, прозрачная).

В отраженном свете рассматривают колонии со стороны крышки, не открывая ее, и фиксируют в протоколе следующие данные:

а) цвет колоний (бесцветные, пигментированные, цвет пигмента);

б) поверхность (гладкая, блестящая, влажная, морщинистая, матовая, сухая и др.);

в) рельеф (выпуклые, погруженные в среду, плоские, с куполообразным центром, с валиком по краю и др.).

Микроскопическое изучение колоний. Чашку устанавливают вверх дном на предметном столике микроскопа, опускают конденсор и с помощью объектива 8х изучают колонии, фиксируя в протоколе их

А) структуру (гомогенная или аморфная, зернистая, волокнистая и др.) и

Б) характер краев (ровные, волнистые, зазубренные, бахромчатые и др.).

В) Из части колоний готовят мазки (при взятии материала из колонии отмечают ее консистенцию — сухая, слизистая, пастообразная),

После изучения культуральных свойств выросшей колонии из ее половины приготавливают мазок, который окрашивают по методу Грама, микроскопируют, определяя морфологические и тинкториальные свойства колонии. После определения культуральных, морфологических и тинкториальных свойств выросшей колонии вторую ее половину пересевают на скошенный агар или чашку Петри с плотной питательной средой, посев помещают в термостат.

Способность бактерий образовывать на питательных средах окрашенные колонии определяется одним из двух факторов:

а) цветом пигмента, продуцируемого микроорганизмами. По химическому строению различают каратиноидные, меланиновые и другие пигменты, которые могут быть красного, оранжевого, жёлтого, коричневого, чёрного, синего или зелёного цвета. Пигментообразование детерминируется генетически. Пигменты обычно находятся в ЦПМ и защищают микробные клетки от эффектов фотоокисления, поэтому пигментообразование больше характерно для воздушной микрофлоры и служит фактором защиты от УФ. Чаще пигменты нерастворимы в питательных средах и окрашивают только колонии. Некоторые пигменты растворимы в воде (например, пиоцианин у псевдомонад) и потому диффундируют в среду, окрашивая её.

Примеры микроорганизмов, продуцирующих пигменты:

Staphylococcus aureus  оранжево-желтый каротиноидный пигмент;

Pseudomonas aeruginosa – сине-зеленый пигмент пиоцианин (при нейтральной реакции - синий, при щелочной – зелёный);

Prevotella melaninogenica, Peptostreptococcus niger – коричнево-черный пигмент.

б) составом среды, на которой культивируют микроорганизмы. В состав селективных или дифференциально-диагностических сред могут входить:

– индикатор рН, цвет которого меняется при разложении углеводов в составе среды;

– красители, которые могут избирательно накапливаться в колониях ферментирующих углеводы микроорганизмов. Например, Escherichia coli разлагают лактозу и образуют на среде Эндо колонии малиново-красного цвета, а на среде Левина – фиолетового, колонии Salmonella spp. и Shigella spp., не разлагающих лактозу, на этих средах бесцветны или слабо-розовые.

– соли двухвалентных металлов, которые окрашивают колонии сероводородпродуцирующих микроорганизмов в серый или черный цвет (черные или серые колонии образуют сальмонеллы на висмут-сульфитном агаре, коринебактерий дифтерии на телуритовом агаре).

Несмотря на множество признаков, которыми различаются колонии, большинство микроорганизмов образуют на средах один из четырех морфотипов колоний:

– гладкие, или S-колонии (от англ. smooth - гладкий) имеют ровные края, гладкую поверхность; они выпуклые, блестящие. S-формы микроорганизмов более вирулентны (исключая Y. pestis, B. anthracis). Такой вид колоний обусловлен присутствием в составе наружных оболочек микроорганизмов гидрофильных полисахаридов.

– шероховатые, или R-колонии (от англ. rough - шероховатый) имеют неровный край, исчерченную поверхность, они плоские, не блестят. R-формы микроорганизмов часто авирулентны. Такой вид колоний связан с гидрофобностью наружных оболочек бактерий из-за отсутствия в них гидрофильных полисахаридов.

– слизистые, или мукоидные, или М-колонии (от англ. mucus – слизистый) – у клебсиелл, имеющих выраженную полисахаридную макрокапсулу;

– карликовые, или D-колонии – у микоплазм и L-форм; видны только под малым увеличением микроскопа.

Под действием ряда факторов может происходить переход бактерий из S- в R-формы, называемый диссоциацией. Явление диссоциации у патогенных микробов наблюдается:

а) под действием химиопрепаратов;

б) под действием факторов иммунитета;

в) при попадании микроба во внешнюю среду.

При обилии в засеваемом материале микробов они растут в виде плёнки, покрывающей всю поверхность плотной питательной среды. Такой характер микробного роста получил название газонного. Посев газоном производят, когда нужно получить большие количества чистой микробной культуры (например, при определении чувствительности её к антибиотикам).