ОпределениеуровняэкспрессиигеновсемействJun,Fra,FosиAtFврежимереальноговремени Взятиеипервичнаяобработкаисследуемогоматериала.
Вкачествематериаладлямолекулярно-биологическогоисследованиябыливзятыобразцыкожидиаметром4мм,полученныеспомощьюпункцион-нойбиопсии.Заборматериалаизпораженногоинепораженногоучастковкожипроводилиподместнойанестезией1%растворомультракаинаспомощьюдер-матологическогопробойникасоответствующегодиаметра(4мм).Биопсииизнепораженныхучастковкоживыполнялисьнарасстоянииоколо3смотпора-женнойкожи.Производиласьбыстраязаморозкаобразцовпораженнойкоживжидкомазоте.Времяотначалапроцедурызаборабиоптатовдозамораживаниянепревышало15секунд.ИсследованиебылоодобреноЛокальнымкомитетомпоэтикеприИнститутеобщейгенетикиРАНисоответствуетпринципам,из-ложеннымвДекларацииХельсинскогосоглашения.
Анализэкспрессиигенов,кодирующихкомпонентовтранскрипционно-гофактораAp1вбиоптатахкожиизочаговсклеродермии.
ВыделениеРНКизбиоптатовпроводилосьнаколонкахQiagenсогласностандартномупротоколуRNeasyMiniKit®длякожи.Чтобыосвободитьпрепа-ратыРНКотпримесейДНКпроводиласьихобработкаДНКазойQiagen.
Далеекфрагментутканидобавляли300µlRLTбуфера(содержащегоβ-ME)ипроводилинемедленнуюгомогенизацию.Кполученномугомогенатудо-бавляли590µlddH2Oи10µlпротеиназыK(10мг/мл,AppliChem,USA)ипере-мешивалиметодомпипетирования.Смесьинкубировали10минпри55°С,аза-темцентрифугировали3минпри10000gприкомнатнойтемпературе,асупер-натант(около900µl)переносилсявновуюпробирку.
Ксупернатантудобавлялиполовинуобъема(около450µl)этанола96%.700µlобразца,включаяпреципитат,переносилинаRNeasyminiколонку,встав-леннуюв2-хмлпробирку,ицентрифугировали15секнаскорости10000об/мин.Жидкостьизпробиркиудалялась,послечегоповторялипредыдущийэтап.
Колонкапромываласьспомощью350µlBufferRW1,послечегопроизво-диласьобработкаферментомДНКазой.Дляэтого10µlисходногораствораDNaseIс70µlBufferRDDдобавлялинаповерхностьсиликагеляиоставлялиприкомнатнойтемпературена15мин.Колонкупромывали350µlBufferRW1идважды500µlBufferRPE.
РНКэлюировали60µlRNAase-freeH2O
КонцентрацияРНКизмеряласьспомощьюспектрофотометраNanoDrop1000(ThermoScientific,США),послечегообразцывыравнивалипоконцентра-циивddH2O.
Обратнаятранскрипцияпроводиласьследующимобразом.ВпробиркидляПЦРобъемом200мклвносили:буфер,dNTP,100ед.обратнойтранскриптазыM_MLV(Promega), 20ед.ингибитораРНК_азRNasin (Promega),500нгoligo(dT)праймеров(ДНК_Синтез)иРНКдоконечнойконцентрациинеболее100нг/мкл,послечегоосуществлялосьтермостатированиесмесиодинчаспри37°С.
ДляконтроляотсутствияпримесиДНКвобразцеРНКпроводилиПЦРнафрагментгенаJUND(forwardprimer5’-AGCTCACAGTTCCTCTACCC-3’,reverseprimer5’-GCTGGTTCTGCTTGTGTAAATC-3’)безобратнойтранскрип-ции.
СцельюконтролявыделенияРНКиобратнойтранскрипции,атакжедлянормализацииколичестваРНКвобразцахпроводилиПЦРспраймерамина
«гендомашнегохозяйства»GAPDH(forwardprimer5'-TGCMTCCTGCACCACCAACT,reverseprimer5'-YGCCTGCTTCACCACCTTC).
ПЦР вреальномвременипроводилив96-луночныхоптическихплашкахсиспользованиеммеченыхфлуоресцентнымиагентамиолигонуклеотидныхпроб.Реакциюпроводилисиспользованием2,5-хкратнойреакционнойсмесисреференснымкрасителемROX(Синтол).Праймерыипробыбылисинтезированыфирмой«ДНК-Синтез»(табл.8).
АмплификацияпроводиласьвПЦР-амплификатореBio-Rad,iQ4,сиспользованиемследующейпрограммы:(1)втечение4минденатурацияпри95°С,(2)втечение15секденатурацияпри94°С,(3)втечение15секотжигпри55°С,(4)втечение15секэлонгацияпри72°С,(5)этапы2-4повторяли50раз.ЭкспериментальнаяработапоизучениюэкспрессиигеновбылапроизвеженанабазелабораториифункциональнойгеномикиИнститутаобщейгенетикиРАН.
ДляприготовлениястандартовпроизводилосьлигированиепродуктовамплификациивT-векторpAL-TA(Евроген).СпомощьюнабораQIAprep(Qiagen)осуществлялосьвыделениеплазмиды.Концентрациюплазмидыизме-рялинаспектрофотометреEppendorf.
Экспрессиюгенов-мишенейнормализовалинагендомашнегохозяйства
GAPDH.
Вкачествестандартовбылаиспользованасерияизчетырехдесятикрат-ныхразбавлений.
Таблица8Последовательностипраймеровипроб,используемыедляопределенияуровняэкспрессиигеновприпомощиПЦР-РВ
№ |
Гены |
Последовательность5'-3' |
1 |
GAPDH |
Наборпраймеровипробакомпании«ДНК-синтез» |
2 |
JUNB |
FAM-CGCGATCСACAGCTACGGGATACGGCCGATCGCG-BHQ1AATGGAACAGCCCTTCTACC GGTTTCAGGAGTTTGTAGTCG |
3 |
C-FOS |
FAM-CGCGATCGGGCGGAGACAGGTGGGCGGATCGCG-BHQ1AGTGACCGTGCTCCTACC CATCATCGTGGCGGTTAGG |
4 |
C-JUN |
FAM-CGCGATCCTGGCTGGCTGGCTGTGTCTGTGATCGCG-BHQ1ACTGAGTGTGGCTGAAGC CTGGGCAGTTAGAGAGAAGG |
5 |
JUND |
FAM-CGCGATCCСTCGGCGAACTCCTGCTCCTGATCGCG-BHQ1AGCTCACAGTTCCTCTACCC GCTGGTTCTGCTTGTGTAAATC |
6 |
FRA-1 |
FAM-CGCGATCAGAAGAAGTTGCTGGAGTTGGATGTGGGATCGCG-BHQ1 CACCCTAGCCAATGTCTCCGAAGCACAATATGGTCAGTCTC |
7 |
FRA-2 |
FAM-CGCGATCGATCACTGTGGGCTGCACCATCCAGATCGCG-BHQ1 CATTCATCCCCACCATCAACGGTGCGAGCGAGGGTATGG |
8 |
FOSB |
FAM-AGAGGAGACGCTCACCCCAGAGGAA-BHQ1CCACCAGCGGAACTACCAGTGGCCTGGAGTCGGTCGGTCAG |
9 |
ATF1 |
FAM-CGCGATCCGTCAGAGACAGCACCTCAACCGATCGCG-BHQ1CACAGTTGATTATGGAAGATTC TGATACCTGTTGAGCAATATG |
10 |
ATF3 |
FAM-ACCCAGTGCTGCTCTCCCATCTCCC-BHQ1CTGAAGAAGAGGGTCTGCATTTTCTCATCAAGCTGCGAGAGGAAG |
11 |
ATF4 |
FAM-CGCGATAACGCTGCTGCTGAATGCCGATCGCG-BHQ1CTAATGGGAGTTGGCTTCTG CGGTGCTTTGCTGGAATC |
ДляподтверждениястатистическойдостоверностиданныхПЦРвреаль-номвременииспользовалиметод2-ΔΔCT(рис.1)
.
Рис.1.ГрафикПЦРвреальномвременистандартовдлягенаGAPDHиоб-разцовдлягенаJUNB