XIV. Серологические реакций.

В иммунологических и бактериологических лабораториях, реакций между антигенами

и антителами in vitro широко применяются в различных целях, в частности для:

- серодиагностики бактериальных, вирусных и других инфекционных болезней;

- сероидентификации бактерий, вирусов и других микроорганизмов.

Серодиагностику проводят с помощью диагностических наборов, выпущенных коммерче-

скими фирмами. По результатам серолгических реакций судят о динамике антител или нали-

чии антигена в сыворотке крови.

Сероидентификацию микробных культур проводят с целью установления их вида и серова-

ра.

Любая серологическая реакция характеризуется специфичностью и чувствительностью.

Под специфичностью подразумевается свойство определенного антигена или антитела связа-

ться в сыворотке крови (или in vitro) только с гомологичным антителом или антигеном. Чем

выше специфичность, тем меньше ложноположительных или ложноотрицательных результа-

тов.

В серологических реакциях участвуют антитела, которые принадлежат в основном иммуно-

глобулинам класса IgG и IgM.

В таблице 2 представлены основные серологические реакции, применяемые в иммунологии

и диапазоны их чувствительности.

Основные серологические реакции таблица 2

П/н #	Методы	Чувствительность гр/мл
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.	Реакция преципитации Реакция агглютинации Реакция cвязывания комплемента Реакция пассивной гемагглютинации Метод иммунной флуоресценции Реакция коагглютинации Встречный имуноэлектрофорез Иммуноферментный и радиоиммунный анализ Вестерн-блоттинг	104 - 106 106 - 107 106 107 – 109 107 108 - 109 106 - 107 109 и менее 107 - 109

На сегодняшний день существующие все серологические реакций можно разделить на

несколько групп:

1. Реакции, протекающие с укрупнением антигенов в растворе электролита (физиологи-

ческий раствор,буфер и т.). К ним относятся – агглютинация, пассивная агглютинация,

преципитация и ее варианты.

2. Реакции, которые протекают нейтрализацией антигена – реакция нейтрализации токс-ина, реакция нейтрализации вируса, реакция торможения гемагглютинации.

3. Реакции, протекающие с участием комплемента – реакция фиксации комплемента, ре-

акция гемолиза и ее модификации.

4. Реакции, протекающие с участием фагоцитов – опсоно-фагоцитарная реакция и др.

5. Реакции, протекающие с участием меченных антигенов или антител – реакция имму-

нофлуоресценции, радиоиммунный и иммуноферментный анализы (РИА,ИФА).

Реакция агглютинации. Реакция агглютинации (от латин.agglutinatio – приклеивание) –

это склеивание и выпадение в виде осадка корпускулярных антигенов – бактерий, эритроци-

тов и других частиц под воздействием гомологичных антител. Реакция протекает в две фа-

зы. В первой фазе происходит адсорбция специфических антител на мембране корпускуляр-

ных антигенов, во второй – образование агрегата (агглютината) и выпадение в виде осадка.

Указанный процесс протекает только в среде электролитов (раствор хлорида натрия).

Для диагностики инфекционных заболеваний, реакция агглютинации применяется в двух

целях: 1. Для установления вида выделенного микроба путем использования агглютиниру-

ющей сыворотки, 2. Для выявления антител в сыворотке крови с помощью стандартного ми-

кробного диагностикума или другим методом.

Агглютинины – антитела, обладающие свойством склеивать гомологичные микробы и об-

разовывать агглютинат, видимый невооруженным глазом. По характеру сформированного

агглютината различают зернистую и хлопьевидную агглютинацию. Зернистая агглютина-

ция происходит при склеивании микробов, содержащих О- антиген. Бактерии, имеющие жгу-

тики (Н-антиген), агглютинируются с образованием крупных хлопьев.

В зависимости от вида используемого иммунодиагностикума различают реакцию микроб-

ной агглютинации, гемагглютинации, латекс-агглютинации, коагглютинации и т.д.

Реакция агглютинации является специфической, хотя может иметь место групповая аг-

глютинация, т.е. склеивание близкородственных микробов в низких титрах. Иначе говоря, ан-

тисыворотки против определенных микробов, агглютинируют и другие близкородственные

микробы, хотя и в низких титрах.

Антигенная структура бактерий различна. Одни и теже штаммы бактерий содержат группо-

вые, видовые и типовые антигены. Стоящие близко друг к другу бактерий содержат общие

(идентичные) антигены. Последние определеют агглютинацию бактерий негомологичными

сыворотками.

Таким образом, при иммунизации животных микробами одного вида, вырабатываются ан-

титела не только к данным бактериям, но и к близкородственным бактериям, содержащим об-

щие групповые антигены. Для получения моноспецифических сывороток, используемых с

целью идентификации микробов, используют метод адсорбции агглютининов (реакция Кас-

телани). Суть реакции заключается в том, что в агглютинирующую сыворотку последовате-

льно добавляют близкородственные микробы, несущие групповые антигены. После инкуба-

ции (15-20 мин при 37^oC) путем центрифугирования удаляют добавленные. Этим методом

получают адсорбированные сыворотки, которые содержат антитела только к определенно-

му виду микроба.

В серологических реакциях особое значение придают отрицательным зонам (прозоны)

агглютинации. При высокой или низкой концентрации антител в сыворотке, реакция агглю-

тинации не протекает. Кроме этого, задержку агглютинации могут вызвать: низкое качество

антигена, высокая или низкая концентрация водородных ионов (рН), недостаток электро-

литов, наличие неполных и денатурированных антител.

Реакция агглютинации широко применяется для диагностики брюшного тифа, бруцеллеза,

туляремии и других инфекций. Для определения групп крови используют стандартные О, А,

В- сыворотки. С помощью реакции агглютинации устанавливают совместимость крови по

основным антигенам. С этой целью смешивают кровь донора и реципиента с соответству-

ющими сыворотками и оценивают степень агглютинации и принадлежность к группе крови.

В клинической практике применяется реакция агглютинации лейкоцитов, тромбоцитов и

других клеток, а также для выявления аутоантител и определения наличия антигенов на ука-

занных клетках.

Реакция пассивной (непрямой) агглютинации является высокочувствительной и специ-

фической реакцией. Для получения феномена пассивной агглютинации предварительно

нагружают (адсорбируют,сенсибилизируют) корпускулярные носители – инертные частицы

(латекс, целлюлоза, полистирол) или эритроциты (эритроциты барана, I группа человека).

Для постановки РПГА предварительно готовят формалинизированные и танизированные

эритроциты барана, нагруженные (сенсибилизированные) антигенами или антителами. Ан-

тигены и антитела, используемые для нагрузки эритроцитов, называются сенситинами. На-

груженные сенситинами эритроциты склеиваются соответствующими антителами или анти-

генами и выпадают на дно пробирки или лунки в виде осадка.

Сенсибилизированные антигенами эритроциты (антигенные диагностикумы) применяют

для выявления антител. Нагруженные антителами эритроциты (антительные,иммуноглобу-

линовые диагностикумы) применяют для обнаружения антигенов.

РПГА широко применяется для диагностики инфекционных (бактериальных, вирусных) и

паразитарных заболеваний. РПГА используют также для диагностики неинфекционных забо-

леваний.

Прямая и непрямая антииммуноглобулиновая реакция Кумбса. Реакция Кумбса при-

меняется для обнаружения неполных (неагглютинирующих) антител, которые появляются

при различных заболеваниях: резус-конфликте, аутоиммунных заболеваниях, некоторых

инфекциях. Для постановки этой реакций необходимо иметь антиглобулиновую сыворотку,

которую получают иммунизацией кроликов иммуноглобулинами человека. Иммунная сыво-

ротка кролика содержит полные (двухвалентные) антитела – антииммуноглобулины против

неполных антител человека.

Прямая реакция: к эритроцитам больного добавляют антииммуноглобулиновую сыворо-

тку. Если на поверхности эритроцитов находятся неполные антитела (как при резус-конфли-

кте и гемолитической анемии), они склеиваются и выпадают в осадок на дно лунки или про-

бирки.

Непрямая реакция дает возможность выявить в сыворотке крови больного свободные (не-

полные) антиэритроцитарные антитела. К указанной сыворотке добавляют эритроциты О(I)

группы. После инкубации суспензии, к смеси добавляют антииммуноглобулиновую сыворот-

ку. В случае наличия в сыворотке крови больного неполных антиэритроцитарных антител по-

лучаем агглютинацию.

Реакция преципитации.

В основе реакции преципитации лежит образование комплекса антиген-антитело и выпаде-

ние в виде осадка. Особенностью реакции является то, что в ней участвуют растворимые

антигены – преципитиногены (продукты распада микробов и тканей, химические вещества,

лекарства). Антитела (преципитины), соединяясь с растворимыми антигенами, вызывают их

аггрегацию, в результате чего прозрачный раствор мутнеет (опалесцирует) и выпадает в виде

преципитата.

Реакция преципитации применяется для обнаружения растворимых антигенов. Реакция пре-

ципитации – специфическая и чувствительная. Она дает возможность обнаружить антигены в

в разведении 1:1.000.000 и 1:10.000.000.

Путем иммунизации лабораторных или крупных животных соответствующими антигенами

получают высокоактивные преципитирующие сывортки, которые применяются для диагно-

стики инфекционных заболеваний.

Иммунодиффузия в геле лежит в основе реакции преципитации по методу Манчини, кото-

рая применяется для определения классов иммуноглобулинов в сыворотке крови человека.

Реакция преципитации применяется: для выявления бактериальных антигенов, тканевых

антигенов чело века и животных; в судебной медицине для установления видовой принадле-

жности; в санитарной практике для обнаружения недопустимых примесей в мясных, рыбных,

и мучных продуктах.

Реакцию преципитации можно проводить как в жидкой, так и плотной среде.

В жидкой среде преципитацию (кольцепреципитация) ставят в узких пробирках. В пробир-

ки вносят преципитирующую сыворотку, к которой сверху осторожно наслаивают прозрач-

ный раствор антигена. В случае положительной реакций на границе соприкосновения двух

растворов образуется кольцо преципитации.

Преципитация в агаре. Суть реакции заключается в том, антигены и антитела, расположе-

нные в разных лунках, диффундируют в направлении друг к другу и на месте соприкоснове-

ния образуют линию (или дугу) преципитации.

Двойная радиальная диффузия по Оухтерлони. Реакцию ставят в пластинчатом агаро-

вом геле. Растворы антигена и антисыворотки вносят в лунки, удаленные друг от друга на

определенном расстоянии. Диффундирующие в направлении друг к другу иммунореаге-

нты образуют иммунокомплексы, выявляющиеся в виде полосы преципитации. Этот ме-

тод дает возможность исследовать одновременно несколько антигенов или сывороток.

В медико-биологических исследованиях применяют высокочувствительные методы –

иммуноэлектрофорез и иммуноблоттинг.

Иммуноэлектрофорез представляет собой совокупность электрофореза и иммунодиффузии.

Первым долгом проводят разделение исследуемых белков с помощью электрофореза, затем

вдоль реакции сделанную канавку вносят преципитирующую сыворотку. На месте встречи

встречи антигена и антител образуется дуга преципитации. Указанным методом качествен-

ный анализ сывороточных белков, спинномозговой жидкости, белков бактериального проис-

хождения.

Отличие иммуноблоттинга в том, что индикация антигенов или антител (после проведения

электрофореза) осуществляется меченными антителами.

Реакция нейтрализации. В основе реакции лежит способность антител нейтрализовать

in vitro биологически активные антигенсодержащие субстраты: токсины, вирусы, змеиные

яды и др.

Различают следующие варианты реакций нейтрализации:

1. Реакция флокуляции, которая основана на способности токсина при смешивании в

эквивалентных отношениях с антитоксической сывороткой образовывать помутнение в про-

бирках. Реакция флокуляции применяется для количественного определения токсина и анти-

токсина.

2. Реакция нейтрализации in vivo. Применяется у детей при дифтерий для оценки ан-

титоксического иммунитета. С этой целью в области предплечья внутрикожно вводят незна-

чительное количество токсина (1/40 DLM). Если на месте введения токсина не развилось по-

краснение и припухлость, это указывает о нейтрализации токсина антителами, существую-

щими в организме. При отсутствии в организме антитоксических антител на месте введения

токсина развивается воспалительная реакция.

3. Реакция нейтрализации вирусов. Применяется для идентификации вирусов. С этой

целью к исследуемому материалу добавляют антивирусную сыворотку, инкубируют и зара-

жают лабораторных животных, куриные эмбрионы или тканевую культуру. В случае гомоло-

гии антигенов и антител (т.е. нейтрализации вируса), животное не погибает, в курином эмб-

рионе и культуре ткани не развиваются патологические изменения. Если антигены и анти-

тела не гомологичны – животные и куриные эмбрионы погибают, в тканевой культуре разви-

ваются цитопатогенные процессы.

Иммунофлюоресцентный метод. Реакция иммунофлуоресценции основана на взаимодей-

ствии антигена с антителами, меченными флюорохромом. Антигены могут быть локализова-

ны на клетках, в клетках или ткани. В качестве флюорохрома применяют флюоресцеина изо-

тиоцианат (ФИТЦ), который в люминесцентном микроскопе под воздействием ультрафиоле-

товых лучей дает зеленое свечение.

В зависимости от цели исследования применяют прямой и непрямой методы реакции им-

мунофлуоресценции. Прямой метод является одноэтапным. С этой целью фиксированный

на предметном стекле мазок обрабатывают меченными антителами (диагностическая сыворо-

тка), ставят в термостат, затем смывают. В случае положительной реакций отмечается специ-

фическое свечение.

При использовании непрямого метода исследуемый материал (антиген) сначала обрабаты-

вают обычной кроличьей диагностической сывороткой. Для выявления образовавшегося ком-

плекса антиген-антитело применяют меченные флюорохромом антитела (баранья антисыво-

ротка) против кроличьего иммуноглобулина.

Метод иммунофлуоресценции применяется для диагностики инфекций, вызванных бакте-

риями, вирусами и рикетсиями, а также для определения рецепторов и антигенов на повер-

хности клеток человека и животных.

Иммуноферментный анализ. В методе иммуноферментного анализа (ИФА) применены

меченные ферментами иммунореагенты. В исследовательской работе и клинической диагно-

стике используют различные варианты ИФА, в том числе широко распространенный твердо-

фазный иммуноферментный анализ. Антитело или антиген фиксируется (сенсибилизируют)

в лунках полистироловой пластинки. В лунки добавляют образцы исследуемых сывороток.

После инкубирования смеси в термостате, несоединившийся белки смывают стерильным фи-

зиологическим раствором и добавляют антииммуноглобулиновые антитела, меченные ферме-

нтом. Полистироловую пластинку помещают в термостат. после инкубации и смыва пласти-

нок в лунки вносят специфические субстраты (пероксид водорода) и хромоген (орто-фенил-

ендиамин) для окончательной регистрации результатов. О качественных и количественных

показателях выявленных антител судят по интенсивности окрашивания исследуемого раство-

ра. С этой целью применяют специальные спектрофотометры (мультискан, ридер).

ИФА – высокочувствительный и специфический метод, получивший широкое применение

в различных областях медицины и биологии.

В клинической диагностике с помощью антител (в том числе моноклональных), фиксирова-

нных на твердой фазе, в организме выявляют возбудители заболеваний, определяют концен-

трации лекарственных средств, специфические рецепторы и антигены опухолевых клеток и

т.д. С помощью антигенов, фиксированных на твердой фазе, выявляют антитела против раз-

личных бактерий, вирусов,простейших.Например, адсорбированные антигенами полистиро-

ловые пластинки (планшеты) применяют для диагностики СПИД-а, гепатита и других инфек-

ций.

Радиоиммунный анализ (РИА). Метод основан на выявлении комплекса антиген-антите-

ло, где один из иммунореагентов является меченым радиоактивным изотопом. Обычно с этой

целью применяют изотопы иода – I¹²⁵ I¹³¹. Результаты реакции регистрируют по РИА уве-

личению или снижению радиоактивноси с помощью счетчика гамма-излучения. РИА являе-

тся самым чувствительным иммунологическим методом, но требует соблюдения определен-

ных мер безопастности.

Методы изучения клеточного иммунитета.

Одним из методов изучения клеточного иммунитета является реакция бласттрансформа-

ции. Бласттрасформация представляет собой переход малых лимфоцитов в бластные фор-

мы, обладающие способностью пролиферации и дифференцировки. Этому процессу сопу-

тствуют морфологические изменения в лимфоцитах. Бласт – крупная, круглая клетка, кото-

рая имеет большое ядро. Одна бластная клетка дает клон, состоящий из 32 – 64 клеток.

Бласттрансформация может быть вызвана специфическими антигенами или неспецифиче-

скими стимуляторами – митогенами (фитогемагглютинином, ФГА).

Способностью вызвать бласттрансформацию обладают отдельные вещества животного (сы-

вороточные иммуноглобулины) и растительного (ФГА) происхождения. Установлено, что

некоторые митогены вызывают активацию Т-лимфоцитов (напр.,ФГА), другие – активацию

В- лимфоцитов (липополисахариды).

Способность (свойство) лимфоцитов к бласттрансформации указывает об активности им-

мунокомпетентных клеток , что является характерным для здорового организма. Поэтому,

указанная реакция применяется для оценки иммунного статуса организма.