книги / Наноструктурированная керамика на основе диоксида титана для ортопедического этапа лечения пациентов с переломами и приобретенными дефектами челюстных костей

Рис. 4.19. Операция имплантации опытных образцов животному: имплантат установлен в сформированном ложе костной ткани экспериментального животного (а); контрольный рентгенологический снимок головы морской свинки в боковой проекции после имплантации экспериментальных образцов с диоксид-титановым покрытием (б)

Морских свинок после операции наблюдали в течении 2 ч в подогреваемом боксе под маской с подачей кислорода (рис. 4.20, а).

Рис. 4.20. Наблюдение за экспериментальными животными в послеоперационном периоде (а); снятие швов (10-й день эксперимента) (б)

Дополнительно каждому животному проводили превентивную антибиотикотерапию препаратом «Конвения» (пролонгированное действие в течение 14 дней) в дозировке 8 мг/кг. Обработку швов

171

осуществляли 0,05%-ным раствором хлоргексидина в течение 10 дней. У всех животных в ходе эксперимента швы были без признаков воспалительных явлений, состоятельны. Снятие их проводили на 10-й день после начала эксперимента (см. рис. 4.20, б).

с неорганической кислотой (азотная кислота 1,5%-ная в течение 2 суток), так как бескислотная декальцинация рекомендуется для проведения гистохимических исследований костных образцов [18]. Для уменьшения продолжительности декальцинации брали небольшие кусочки костной ткани (толщиной 0,5 см) и большое количество декальцинирующей жидкости (30–50 мл) с ее заменой каждые 24 ч. После этого препараты промывали водой. Во избежание набухания соединительной ткани объекты на 24 ч помещали в 5%-ный раствор алюмокалиевых квасцов, затем тщательно промывали материал в проточной воде в течение 48 ч. После промывания помещали в спирты восходящей концентрации на 1 сутки в каждый (спирт от 70° до абсолютного). Декальцинированные блоки заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 10 мкм подвергали окрашиванию гематоксилин-эозином, пикрофуксином по Ван Гизону. Качество микропрепаратов оценивали по предложенным

172

Д.Э. Коржевским, Е.Г. Гилеровичем, О.В. Кириком (2013) критериальным признакам: отсутствие нарушения целостности клеточных элементов, отсутствие нарушения декальцинации и окрашивания срезов. При этом все исследованные микропрепараты отвечали предъявляемым требованиям. Для визуализации и фотосъемки полученных препаратов использовали микроскоп Micros (Австрия) в программе Scope Photo с фотокамерой для микроскопа CAM V200, Vision (Австрия), при увеличениях ×40, 150, 400, 600. В на-

стоящее время проблеме наноструктуризации поверхности конструкционного материала отводится все больше внимания в связи с необходимостью улучшения его биосовместимости с тканями, увеличения прочности и снижения числа послеоперационных осложнений. Следует отметить, что сравнительных морфологических данных по вопросам регенерации костной ткани в литературе крайне мало.

В наших исследованиях перед выведением морских свинок из эксперимента (14 недель после имплантации образцов) проводили осмотр тканей в зоне оперативного вмешательства. Макроскопически ни в одном случае воспалительных или иных изменений биотопа выявлено не было. При гистологическом анализе установлено, что реакция костной ткани на введенный титан ВТ5-Л (контроль) и наноструктурированный диоксид титана (опыт) была различной. В частности, в участках, близлежащих к месту введения контрольного образца, костная ткань отличалась от интактной нарушением параллельной ориентации опоясывающих пластинок и большим содержанием тонкостенных капилляров в толще компактного слоя

(рис. 4.22).

Связано это, очевидно, с тем, что в ходе регенерации костной ткани, после периода ее деструкции и последующего развития в ней грануляционной ткани, сформировалась сосудистая сеть, частично сохранившаяся в компактной зоне кости до конца экспериментального исследования. Под слоем опоясывающих пластинок лежали единичные, пространственно не ориентированные формирующиеся остеоны с малым числом циркулярно расположенных костных пла-

173

стинок (рис. 4.23). В зоне имплантации губчатое вещество содержало костный мозг. Костные балки были либо утолщенными, либо малоизмененными.

Рис. 4.22. Компактная костная ткань (1, 3), содержащая тонкостенные сосуды (2), в зоне имплантации титана ВТ5-Л. Окраска по Ван Гизону, увеличение × 300

В ячейках заметными являлись процессы гемопоэза, где содержались адипоциты, тонкостенные сосуды и стромальная ретикулярная ткань (рис. 4.24).

Рис. 4.23. Начальная стадия – формирование остеона (3) в участке компактной кости (1), неправильно ориентированные костные пластинки под надкостницей (2) после имплантации титана ВТ5-Л. Окраска по Ван Гизону, увеличение ×300

174

В ряде участков ячейки были заполнены рыхлой волокнистой соединительной тканью с тонкостенными сосудами. В подобных структурах кроветворения не выявлялось.

Рис. 4.24. Костный мозг в ячейке губчатой части кости (1) с большим содержанием мегакариоцитов (2) и макрофагов.

14 недель. Окраска по Ван Гизону, увеличение ×600

При имплантировании образцов из наноструктурированного диоксида титана костная ткань в зоне операции также имела нарушенное расположение наружных костных пластинок. Тем не менее формирование «остеонов» в ней происходит более активно, что выражалось бо́льшим количеством костных пластинок вокруг кровеносных сосудов (рис. 4.25).

Рис. 4.25. Формирование остеона в компактной части кости (указано стрелкой) при имплантации наноструктурированного диоксида титана. Окраска: гематоксилин-эозин, увеличение ×600

175

Значительная их часть оказалась более зрелой. Формирование остеоноподобных образований, очевидно, характерно при различных вмешательствах на губчатых костях. В частности, В.В. Баниным и Л.В. Овчаровой (2013) такие «остеоны» были выявлены и при замещении дефектов нижней челюсти кроликов ауто- и аллогенным материалом. Очевидно, подобные образования остеоноподобных структур имеются при разных повреждениях губчатых костей. Значительная их часть оказалась более зрелой. Губчатое вещество отличалось утолщенными трабекулами, между которыми располагалась слаборазвитая кроветворная ткань (рис. 4.26).

Рис. 4.26. Утолщенные балки в решетчатой части кости со слаборазвитыми участками кроветворения (1). 14 недель.

Окраска гематоксилин-эозином, увеличение ×300

Полученные морфологические данные свидетельствовали о более ускоренных процессах регенерации костной ткани при имплантации наноструктурированного диоксида титана. Очевидно, на процесс остеогенеза в этом случае влияло одновременно несколько факторов. С большой степенью вероятности можно было предположить активацию стволовых стромальных клеток, локализующихся обычно в строме красного костного мозга, имеющегося в ячейках кости нижней челюсти, а также в соседствующих участках кости.

Еще в 70-х гг. прошлого века академик Н.Г. Хрущов высказал гипотезу, блестяще подтвердившуюся позднее, о наличии в костном мозге особых (некроветворных) стволовых клеток, способных диф-

176

ференцироваться в различные типы клеток соединительной ткани (остео- и хондробласты, фибробласты, адипоциты и гладкомышечные клетки). Образующиеся из них остеобласты участвуют в синтезе различных структур внеклеточного матрикса с доминированием на более поздних стадиях его развития Х, а затем I типа коллагена. Формирующиеся на их основе коллагеновые волокна входят в последующем в состав как опоясывающих костных пластинок, так и остеонов.

Как показало проведенное нами гистологическое исследование, количество «остеонов» при имплантации образцов из диоксида титана превышало таковое после введения титана ВТ5-Л. Вероятно, «наношероховатость» поверхности экспериментального материала способствовала более быстрому и прочному контакту с ней камбиальных клеточных элементов и, следовательно, более ускоренной дифференцировке их в остеобласты. Этим клеткам принадлежит и главная роль в образовании остеоида, в основе которого лежит минерализация костного матрикса. Другим немаловажным фактором

вобразовании костных пластинок в формировании остеонов являются местнонаходящиесяостеобластывсоставепериостаиэндоста.

Вразвивающихся гаверсовых системах просвет центрального канала первоначально выглядел широким. Такие остеоны встречались при введении как опытных, так и контрольных образцов. Это, очевидно, было связано с деятельностью остеокластов, которые обеспечивали лизис образовавшихся при операции костных осколков. В результате освобождающиеся пространства заполнялись кровеносными сосудами, вокруг которых формировались костные пластинки. Эти так называемые растущие остеоны имели слабо развитые костные пластинки, которые лишь по истечении достаточно длительного срока могут достигать необходимой зрелости. В изучаемый период (14 недель) формирование остеогенных структур

вконтроле и опыте еще не заканчивалось. Вместе с тем более зрелых остеонов при использовании наноструктурированного диоксида титана образовывалось больше, чем в контроле, хотя наряду с ними имелись и менее зрелые. Это свидетельствует еще о неполностью завершенном посттравматическом остеогенезе.

177

К локально расположенным камбиальным клеткам относятся также аналоги стволовых остеогенных клеточных элементов в составе внутреннего слоя периоста и индуцибельные периваскулоциты, способные к остеогенезу. В регенерации костной ткани также могут принимать участие остеобласты эндоста, хотя их влияние на остеогенез не является значительным. Последние главным образом воздействуют на гемопоэз, который протекает в пространствах губчатой части кости. В то же время в силу активной деятельности остеобластов при использовании опытных образцов образование костных балок и остеонов шло быстрее. Ячейки, содержащие костный мозг, имели меньшие размеры, чем в контроле. Формирование кости подобной структуры при имплантации наноструктурированного диоксида титана, безусловно, способствует лучшей фиксации имплантата в зоне его введения по отношению к контролю.

Известно, что размер структурной единицы компактного вещества костной ткани – остеона, составляет от 20 до 300 мкм (20 000– 300 000 нм), ультраструктуры костной ткани – остеоцита – 15–45 мкм (15 000–45 000 нм), от тел остеоцитов отходят длинные, 50–60 мкм (50 000–60 000 нм), цитоплазматические отростки толщиной 5–6 мкм (5000–6000 нм). Кроме этого, проведенные исследования В.И. Путляевым (2004) свидетельствуют о том, что для быстрого прорастания костной ткани в имплантат необходимо наличие в последнем пор размером 100–150 мкм. Предварительно проведенная нами сканирующая электронная микроскопия экспериментальных образцов с поверхностным наноструктурированным слоем диоксида титана показала его толщину в 50–70 мкм (50 000–70 000 нм) с расстоянием между ламелярными структурами соответственно в 100 нм (0,1 мкм), что обеспечивает хорошую циркуляцию биожидкостей на границе «костная ткань – конструкционный материал» с адгезией остеобластов, а затем остеоцитов с их отростками в нано- и микропространства имплантированного материала с формированием матрикса. Помимо того, адгезия активных клеток крови также легче происходит на материалах, имеющих развитую поверхность в виде микрорельефа и «шероховатости», чем ускоряется процесс костеоб-

178

разования (биологическая фиксация имплантата) с обеспечением биоинтеграционных и биосовместимых параметров.

Таким образом, проведенные морфологические исследования показали, что использование наноструктурированного диоксида титана способствует ускоренной посттравматической регенерации костной ткани с увеличением не только биосовместимости, но и прочности кости по сравнению с теми же процессами, происходящими при использовании титанового сплава.

179

ГЛАВА V

ИНГИБИРОВАНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ МИКРОБНЫХ ПЛЕНОК

СИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ПОЛИКАТИОННОГО ПЕПТИДА ВАРНЕРИНА НА КОНСТРУКЦИОННЫХ МАТЕРИАЛАХ

НА ОСНОВЕ ДИОКСИДА ТИТАНА*

При планировании последующих экспериментально-лабора- торных исследований особый интерес представляла доказательная база преимуществ лечебного использования полученных и модифицированных материалов, в частности, изучение формирования микробных пленок на поверхностях разработанных конструкционных материалов. Так, исследованиями М.Я. Нидзельского (2013) была выявлена дезинтеграция конструкционного материала в процессе пользования протезов под действием микробных факторов. Кроме этого, микробные пленки являются основополагающим фактором, поддерживающим воспаление слизистой оболочки полости рта у пациентов с ПДЧК. В связи с этим перед проведением моделирования практического использования новых материалов in vivo была исследована возможность предупреждения образования микробных пленок на поверхностях предложенных конструкционных материалах на основе и с введением диоксида титана в полимерный материал в условиях in vitro. Анализ возможностей ингибирования формирующихся и/или расщепления уже сформировавшихся биопленок бактерий Staphylococcus epidermidis 33 под действием низкомолекулярного катионного пептида варнерина проводили на поверхностях экспериментальных образцов диоксида титана, в том числе наномодифицированных, а также образцов из материала Vertex ThermoSens с введением вних наноразмерного диоксида титана ибез него. Лиофилизированный катионный пептид варнерин был получен в Лаборатории биохи-

* Глава написана при участии В.П. Коробова, Л.М. Лемкиной.

180