3. Физиология вирусов (взаимодействие вируса с клеткой).

Вирусы растут только внутриклеточно, т.е. являются облигатными внутриклеточными паразитами. В клетке они могут находиться в различных состояниях. Нарушения, вызываемые вирусами, весьма разнообразны: от продуктивной инфекции с образованием вирусного потомства и гибелью клетки до продолжительного взаимодействия вируса с клеткой в виде латентной инфекции или злокачественной трансформации клетки.

Инфицирование клетки вирусом может иметь следующие последствия:

• разрушение клетки (некроз) в результате цитоцидной инфекции, т.е. репродукция вируса приводит к цитоцидному действию (в культуре клеток происходит цитопатический эффект - клетки округляются, отделяются от соседних клеток, образуются многоядерные гигантские клетки, вакуоли и включения);

• разрушение клетки (апоптоз) в результате инициации вирусом програмированной клеточной гибели, при этом вирусный репликативный цикл часто прерывается;

• разрушение клетки в итоге не самим вирусом, а иммунными реакциями организма;

• вирус находится внутри клетки, но не разрушает ее (латентная инфекция);

• вирус трансформирует клетку организма в раковую клетку.

Хорошо изучены три основных типа взаимодействия вируса с клеткой: продуктивный, абортивный и интегративный.

Продуктивный тип взаимодействия завершается воспроизводством вирусного потомства - многочисленных вирионов и гибелью зараженных клеток (цитоцидное действие). Некоторые вирусы выходят из клеток, не разрушая их (нецитоцидное действие). Абортивный тип взаимодействия не завершается образованием новых вирионов, поскольку инфекционный процесс в клетке прерывается на одном из этапов. Интегративный тип взаимодействия, или вирогения, характеризуется встраиванием (интеграцией), вирусной ДНК в виде провируса в хромосому клетки и их совместной репликацией.

Продуктивный тип взаимодействия вируса с клеткой, т.е. репродукция вируса (от лат. re - повторение, productio - производство), проходит несколько стадий:

1) адсорбция вириона на клеточной мембране;

2) проникновение вириона в клетку, «раздевание» и высвобождение вирусного генома (депротеинизация вируса);

3) синтез вирусных компонентов;

4) сборка реплицированной нуклеиновой кислоты и новых капсидных белков;

5) выход вирусного потомства из клетки.

Адсорбция вириона, т.е. его прикрепление к клеточной мембране, - первая стадия репродукции вирусов. Она происходит в результате взаимодействия поверхностных молекул (белковых лигандов) вируса с мембранными рецепторами клеток вирусов. Белки поверхности вирусов, например гликопротеины липопротеиновой оболочки, узнающие специфические клеточные рецепторы и взаимодействующие с ними, называются прикрепительными белками. Лиганды вирусов и специфические рецепторы клеток имеют различную природу.

Так, гемагглютининовые шипы вируса гриппа связываются с сиаловой кислотой в составе гликопротеинов и гликолипидов (ганглиозидов) клеток дыхательных путей. Гликопротеины вируса иммунодефицита человека взаимодействуют с CD4- молекулами и хемокиновыми рецепторами Т-хелперов, моноцитов и дентритных клеток. Капсидные белки вируса полиомиелита связываются с CD155-молекулой, а капсидные белки риновирусов - с ICAM (молекулой адгезии) клеток. На клетке находятся десятки тысяч специфических рецепторов, поэтому на ней могут адсорбироваться десятки и сотни вирионов, но проникают в клетку только определенные вирионы или их содержимое. В основе избирательности поражения вирусами определенных клеток, тканей и органов (так называемого тропизма) лежат специфичность рецепторов поражаемой клетки и возможность развития в ней репродуктивного цикла вируса (пермиссивные условия клетки). Например, вирусы, репродуцирующиеся преимущественно в клетках печени, называются гепатотропными, в нервных клетках - нейротропными, в иммунокомпетентных клетках - иммунотропными и т.д. Проникновение вирусов в клетку возможно в результате рецепторзависимого эндоцитоза или слияния оболочки вируса с клеточной мембраной. Возможно также сочетание этих механизмов.

Рецепторзависимый эндоцитоз происходит в результате захватывания и поглощения вириона клеткой: клеточная мембрана с прикрепленным вирионом впячиваются с образованием эндосомы (внутриклеточной вакуоли). Эндоцитоз вирусов осуществляется с помощью везикул, покрытых клатрином («ямки, окаймленные клатрином»).

Содержимое эндосомы закисляется, что приводит к слиянию липопротеиновой оболочки сложного вируса с мембраной эндосомы и выходу вирусного нуклеокапсида в цитозоль клетки. Эндосомы объединяются с лизосомами, которые разрушают оставшиеся вирусные компоненты. Пенетрация компонентов вируса в цитозоль обычно происходит в ранних или поздних эндосомах при уменьшенном значении pH. Стали известны новые клатриннезависимые, альтернативные пути соединения вируса с эндосомами. Одним из них может быть макропиноцитоз с образованием крупной вакуоли, окруженной плазматической мембраной, наполненной в основном жидкостью. Другим путем попадания вируса может быть вовлечение эндоплазматического ретикулума. Этот путь начинается с формирования различных везикул (кальвеолярный эндоцитоз). В результате проникновение вируса в цитозоль может происходить на уровне плазматической мембраны, эндосомы, кальвеосомы и эндоплазматического ретикулума.

Слияние вириона с клеточной мембраной характерно только для некоторых оболочечных вирусов (герпесвирусов, парамиксовирусов, ретровирусов), в составе которых имеются белки слияния. В результате взаимодействия вирусного белка слияния с липидами клеточной мембраны вирусная липопротеиновая оболочка интегрирует с клеточной мембраной, а внутренний компонент вируса попадает в цитозоль клетки.

Существует три варианта проникновения безоболочечных вирусов в клетку: мембранный прокол (вирион образует пору в мембране, через которую геном попадает в цитозоль, а капсид в него не попадает; перфорация (капсид переносится через мембрану без основного лизиса мембраны); лизис (вирионы индуцируют поломку мембраны цитоплазматических органелл, что способствует проникновению вируса и его компонентов в цитозоль). Выход безоболочечных (простых) вирусов из эндосомы в цитозоль остается малоизученным.

Попав в клетку, вирусы лишаются многих белков («раздевание», или депротеинизация вирусов). В результате депротеинизации удаляются поверхностные структуры вируса и высвобождается его внутренний компонент, способный вызывать инфекционный процесс. Первые этапы «раздевания» вируса начинаются в процессе его проникновения в клетку путем слияния вирусных и клеточных мембран или же при выходе вируса из эндосомы в цитозоль. Последующие этапы «раздевания» вируса тесно взаимосвязаны с их внутриклеточным транспортом к местам депротеинизации. Для разных вирусов существуют свои специализированные участки «раздевания» в клетке: для пикорнавирусов - в цитоплазме с участием лизосом, аппарата Гольджи, для герпесвирусов - околоядерное пространство или поры ядерной мембраны, для аденовирусов - сначала структуры цитоплазмы, а затем ядро клетки. Конечными продуктами «раздевания» могут быть нуклеиновая кислота, нуклеопротеид (нуклеокапсид) или сердцевина вириона.

Следующей стадией репродукции является синтез белков и нуклеиновых кислот вируса, который разобщен во времени и пространстве.

Синтез вирусных белков. В вирусинфицированной клетке синтезируются две группы белков: неструктурные белки, обслуживающие разные этапы репродукции вируса; структурные белки, которые входят в состав вириона (нуклеопротеины, связанные с геномом вируса, капсидные и оболочечные белки). К неструктурным белкам относятся: ферменты синтеза нуклеиновых кислот (РНК или ДНК-полимеразы), обеспечивающие транскрипцию и репликацию вирусного генома; белки-регуляторы; предшественники вирусных белков, отличающиеся своей нестабильностью в результате быстрого нарезания на структурные белки; ферменты, модифицирующие вирусные белки, например протеиназы и протеинкиназы.

Синтез белков в клетке осуществляется в соответствии с хорошо известными процессами транскрипциипутем «переписывания» генетической информации с нуклеиновой кислоты в нуклеотидную последовательность иРНК, или мРНК, и трансляции - считывания иРНК на рибосомах с образованием белков. Передача наследственной информации в отношении синтеза иРНК у разных групп вирусов неодинакова.

• ДНК-содержащие вирусы имеют ДНК-геном, транскрибирующийся в ядре клетки с помощью клеточной РНК-полимеразы, в результате чего образуется иРНК, которая транслируется с образованием белка вируса. Особенностью этого процесса является синтез иРНК в ядре с помощью клеточной РНКполимеразы (у аденовирусов, папилломавирусов, герпесвирусов) или в цитоплазме с помощью собственной РНКполимеразы (у поксвирусов). Таким образом, синтез белка реализуется по схеме: геномная ДНК вируса → транскрипция иРНК → трансляция белка вируса.

• Плюс-нитевые РНК-содержащие вирусы (пикорнавирусы, флавивирусы, тогавирусы) имеют геном, выполняюший функцию иРНК; он распознается и транслируется рибосомами. Белки этих вирусов синтезируются без процесса транскрипции по схеме: геномная РНК вируса - трансляция белка вируса.

• Минус-нитевые РНК-содержащие вирусы (минусоднонитевые - ортомиксовирусы, парамиксовирусы, рабдовирусы и двунитевые - реовирусы) имеют геном, выполняющий роль матрицы, с которой транскрибируется иРНК, при участии РНК-полимеразы, связанной с нуклеиновой кислотой вируса. Синтез белка у них происходит по схеме: геномная РНК вируса - транскрипция иРНК - трансляция белка вируса.

• Ретровирусы (ВИЧ, онкогенные ретровирусы) имеют диплоидный геном, состоящий из двух идентичных молекул РНК. В состав ретровируса включена вирионная обратная транскриптаза, или ревертаза, с помощью которой осуществляется процесс обратной транскрипции, т.е. на матрице геномной РНК синтезируется комплементарная однонитевая ДНК. Комплементарная нить ДНК копируется с образованием двунитевой комплементарной ДНК, которая интегрирует в клеточный геном и в его составе транскрибируется в иРНК с помощью клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Синтез белков ретровирусов осуществляется по схеме: геномная РНК вируса - комплементарная ДНК - транскрипция иРНК - трансляция белка вируса.

Репликация вирусных геномов, т.е. накопление копий вирусных геномов, которые используются при сборке вирионов в клетке, отличается у вирусов, имеющих двунитевую ДНК, однонитевую ДНК, плюс-однонитевую РНК, минус-однонитевую РНК, двунитевую РНК и идентичные плюс-нитевые РНК (ретровирусы).

• Двунитевые ДНК-вирусы. К ним относятся вирусы, содержащие двунитевую ДНК в линейной (герпесвирусы, аденовирусы и поксвирусы) или кольцевой (папилломавирусы и полиомавирусы) форме. В репликации вирусных геномов участвуют вирусные ДНК-зависимые ДНК-полимеразы (у аденовирусов, герпесвирусов и поксвирусов) или клеточные ДНК-зависимые ДНК-полимеразы (у папилломавирусов, полиомавирусов и анелловирусов). Двунитевые вирусные ДНК реплицируются обычным полуконсервативным механизмом: после расплетения нитей ДНК к ним комплементарно достраиваются новые нити. Каждая вновь синтезированная молекула ДНК состоит из одной родительской и одной вновь синтезированной нити. У всех вирусов, кроме поксвирусов, транскрипция вирусного генома происходит в ядре. Своеобразный механизм репродукции с включением процесса обратной транскрипции имеют гепаднавирусы

• Однонитевые ДНК-вирусы представлены парвовирусами, которые используют клеточную ДНК-полимеразу для создания двунитевого вирусного генома, так называемой репликативной формы последнего. При этом на исходной вирусной ДНК (плюс-нить) комплементарно синтезируется минус-нить ДНК, служащая матрицей для синтеза плюс-нити ДНК нового вириона. Параллельно синтезируется иРНК, происходит трансляция вирусных пептидов.

• Плюс-однонитевые РНК-вирусы включают большую группу вирусов (пикорнавирусы, флавивирусы, тогавирусы), у которых геномная плюс-нить РНК выполняет функцию иРНК - матрицы для синтеза белка. На ее основе синтезируется полипротеин, который расщепляется на фрагменты: вирусные РНК-зависимую РНК-полимеразу, протеазы и капсидные белки. Вирусная РНК-полимераза транскрибирует геномную плюс-нить РНК в минус-нить РНК, на матрице которой синтезируется геномная плюс-нить РНК. Вирионы формируются в цитоплазме.

• Минус-однонитевые РНК-вирусы (аренавирусы, борнавирусы, рабдовирусы, парамиксовирусы, ортомиксовирусы, филовирусы) имеют вирионную РНК-зависимую РНКполимеразу. Проникшая в клетку геномная минус-нить РНК трансформируется вирионной РНКзависимой РНК-полимеразой в неполные и полные плюс-нити РНК. Неполные копии выполняют роль иРНК для синтеза вирусных белков. Полные копии являются матрицей (промежуточная стадия) для синтеза минус-нитей геномной РНК потомства. Вирионы формируются в цитоплазме.

• Двунитевые РНК-вирусы. Репликация этих вирусов (реовирусы и ротавирусы) сходна с репликацией минус-однонитевых РНК-вирусов. Образовавшиеся в процессе транскрипции плюснити РНК не только функционируют как иРНК, но и участвуют в репликации: они являются матрицами для синтеза минус-нитей РНК. Последние в комплексе с плюс-нитями РНК образуют геномные двунитевые РНК вирионов. Репликация вирусных нуклеиновых кислот этих вирусов происходит в цитоплазме клеток.

• Вирусы с обратной транскрипцией. К обратно-транскрибирующимся вирусам относятся представители семейств Retroviridae и Hepadnaviridae. Ретровирусы, в частности ВИЧ, являются плюс-нитевыми диплоидными РНК-содержащими вирусами. Вирионная обратная транскриптаза ретровирусов синтезирует (на матрице РНК вируса) минус-нить ДНК, с которой копируется плюс-нить ДНК с образованием двойной нити ДНК, замкнутой в кольцо. Далее двойная нить ДНК интегрирует с хромосомой клетки, образуя провирус. В результате транскрипции одной из нитей интегрированной ДНК при участии клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразы образуются вирионные РНК.

Формирование вирионов. Белки и нуклеиновые кислоты вируса синтезируются в разных частях клетки, вследствии чего этот способ репродукции вирусов получил название дисъюнктивного (от лат. disjunctus - разобщенный). Синтезированные компоненты вириона транспортируются в различные участки ядра или цитоплазмы клетки - места сборки вируса, которая происходит с участием гидрофобных, ионных, водородных связей и стерического соответствия.

Формирование вирионов - многоступенчатый процесс с образованием промежуточных форм, отличающихся от зрелых вирионов по составу полипептидов. Сборка простых вирусов заключается во взаимодействии вирусных нуклеиновых кислот с капсидными белками и образовании нуклеокапсидов. У сложных вирусов сначала формируются нуклеокапсиды, которые окружаются модифицированной мембраной клетки (будущей липопротеиновой оболочкой вируса). В процессе сборки вирионов в их структуры включаются отдельные липиды и углеводы клетки-хозяина. Так, формирование вирионов в ядре клетки происходит с участием мембраны ядра, а формирование вирионов в цитоплазме - с участием мембран эндоплазматической сети или плазматической мембраны, куда встраиваются гликопротеины и другие белки оболочки вируса.

У ряда сложных минус-нитевых РНК-вирусов (ортомиксовирусов, парамиксовирусов) в сборку вовлекается матриксный белок (М-белок), расположенный под модифицированной клеточной мембраной - будущей оболочкой вириона. Обладая гидрофобными свойствами, он выполняет роль посредника между нуклеокапсидом и липопротеиновой оболочкой вируса.

Выход вирусов из клетки. Продолжительность цикла вирусной репродукции колеблется от 6-8 ч (вирус гриппа, пикорнавирусы) до более чем 40 ч (некоторые герпесвирусы). Вирусное потомство составляет 10-1000 зрелых вирионов и в несколько раз большее количество дефектных вирионов. Репродукция вирусов заканчивается выходом их из клетки, который происходит взрывным путем почкованием или экзоцитозом.

• Взрывной путь характерен для простых (безоболочечных) вирусов: из погибающей клетки одновременно выходит большое количество вирионов.

• Почкование, экзоцитоз присущи сложным вирусам, имеющим липопротеиновую оболочку, которая является производной от клеточных мембран. Сначала образовавшийся нуклеокапсид или сердцевина вириона транспортируется к участкам клеточных мембран, в которые уже встроены вирусспецифические белки, после чего начинается выпячивание этих участков. Сформировавшаяся почка отделяется от клетки в виде сложного вируса, а клетка может длительно оставаться жизнеспособной, продуцируя вирусное потомство. Вирусы, формирующиеся в ядре клетки (например, герпесвирусы) почкуются в перинуклеарное пространство через модифицированную ядерную мембрану, приобретая таким образом липопротеиновую оболочку. Затем они транспортируются в составе цитоплазматических везикул на поверхность клетки. Почкование вирусов, формирующихся в цитоплазме, может происходить либо через плазматическую мембрану (например, парамиксовирусы, тогавирусы), либо через мембраны эндоплазматической сети с последующим их выходом на поверхность клетки (буньявирусы).