11. Вирусологический метод диагностики, этапы.

Вирусологический метод включает два основных этапа: выделение вирусов и их идентификацию. Материалами могут быть кровь, другие биологические и патологические жидкости, биоптаты органов и тканей.

Вирусологическое исследование крови часто проводят с целью диагностики арбовирусных инфекций. В слюне могут быть обнаружены вирусы бешенства, эпидемического паротита, простого герпеса. Носоглоточные смывы служат для выделения возбудителей гриппа и других ОРВИ, кори. В смывах с конъюнктивы обнаруживают аденовирусы. Из фекалий выделяют различные энтеро-, адено-, рео- и ротавирусы.

Для выделения вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы, иногда лабораторных животных. Большинство патогенных вирусов отличает наличие тканевой и типовой специфичности, например, полиовирус репродуцируется только в клетках приматов, поэтому для выделения определенного вируса используют соответствующую культуру ткани. Для выделения неизвестного возбудителя целесообразно одномоментно заражать 3—4 культуры клеток, предполагая, что одна из них может оказаться чувствительной. Наличие вируса в зараженных культурах определяют по развитию специфической дегенерации клеток, т.е. цитопатогенному действию, обнаружению внутриклеточных включений, а также на основе выявления специфического антигена методом иммунофлюоресценции, положительных реакций гемадсорбции и гемагглютинации. Эмбрионы птиц с их малодифференцированными тканями пригодны для культивирования очень многих вирусов. Чаще всего используют эмбрионы кур. При размножении в эмбрионах вирусы могут вызвать их гибель (арбовирусы), появление изменений на хорион-аллантоисной оболочке (оспенные вирусы) или в теле эмбриона, накопление в эмбриональных жидкостях гемагглютининов (вирусы гриппа, паротита) и комплементсвязывающего вирусного антигена.

Вирусы идентифицируют с помощью иммунологических методов: реакции торможения гемагглютинации, связывания комплемента, нейтрализации, преципитации в геле, иммунофлюоресценции.

12. Выделение и титрование бактериофагов.

Получение фаголизатов

Для получения лизата фага чувствительные бактерии заражают фагом и инкубируют, чтобы произошло размножение фага в бактериальной клетке с последующим ее лизисом. Для окончательного разрушения клеточной стенки добавляют хлороформ. Затем проводят центрифугирование. Отбирают надосадочную жидкость (фаголизат), которую хранят на холоде в закрытой резиновой пробкой пробирке или пробирке с завинчивающейся крышкой.

• 0,2 мл бульонной культуры E. coli засевают в 20 мл L-бульона (1% пептон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,5% раствор натрия хлорида при температуре 37 °С, 0,1% глюкоза) и аэрируют в течение 2,5 ч при температуре 37 °С до достижения концентрации 108 клеток/мл.

• Добавляют фаголизат в соотношении 1:10 и продолжают аэрацию до тех пор, пока культуральная среда не просветлеет.

• Добавляют несколько капель хлороформа, встряхивают, оставляют на несколько минут.

• Проводят центрифугирование при 3000 об./мин в течение 25 мин.

Отбирают надосадочную жидкость.

Определение титра фага методом агаровых слоев по Грацию.

На поверхность плотного слоя питательного агара в чашке Петри наносят смесь фаголизата и чувствительной бактерии в полужидком агаре. Чашку инкубируют. За время инкубации каждая бактерия, присутствующая в посевном материале, образует маленькую колонию, и на поверхности агара образуется сплошной рост бактерий. Фаговые частицы, присутствующие в смеси, заражают бактерии, размножаются в них и лизируют бактериальные клетки, из которых высвобождается новое поколение фагов. Этим фаги заражают соседние бактерии. Процесс размножения фага и бактериального лизиса повторяется снова и снова, таким образом, на бактериальном газоне появляются зоны лизиса в виде бляшек. При низкой множественности заражения каждая бляшка (стерильное пятно) образуется одной фаговой частицей.

• Пробирки с 0,5% агаром в объеме 5 мл помещают в водяную баню при температуре 45 °С для расплавления.

• Готовят разведения фаголизата в физиологическом растворе - 10-2 , 10-4 , 10-6 , 10-8 .

• По 0,1 мл каждого разведения фаголизата вносят в пробирки с расплавленным 0,5% агаром.

• В эти же пробирки вносят по 0,1 мл бактериальной культуры, выращенной в L-бульоне.

• Хорошо перемешивают содержимое пробирок (вращая между ладонями) и выливают на мясо-пептонный агар (МПА), равномерно распределяя по поверхности чашки.

• После того как верхний слой агара застынет, чашки подписывают и помещают в термостат на 24 ч.

• На следующие сутки подсчитывают количество бляшек (стерильных пятен), определяют титр фага по формуле: число бляшек / разведение фага × 0,1 (объем внесенного фаголизата).