7. Применение бактериофагов в медицине и микробиологии.

Бактериофаги используют в лабораторной диагностике инфекций при внутривидовой идентификации бактерий, т.е. определении фаговара (фаготипа). Для этого применяют метод фаготипирования, основанный на строгой специфичности действия фагов: на чашку Петри с плотной питательной средой, засеянной «газоном» чистой культурой возбудителя, наносят капли различных диагностических типоспецифических фагов. Фаговар бактерии определяется тем типом фага, который вызвал ее лизис (образование стерильного пятна, бляшки или негативной колонии). Метод фаготипирования позволяет выявить источник инфекции и проследить путь возбудителя от источника до восприимчивого организма (эпидемиологическое маркирование).

По содержанию бактериофагов в объектах окружающей среды можно судить о присутствии в них соответствующих патогенных бактерий. Подобные исследования проводят при санитарно-микробиологическом исследовании воды. Например, в системах из поверхностных источников воды перед подачей ее в распределительную сеть определяют наличие колифагов. Колифаги являются одними из санитарно-показательных микробов, характеризующих фекальное загрязнение воды.

Фаги применяют также для лечения и профилактики ряда бактериальных, чаще всего кишечных инфекций. Производят брюшнотифозный, дизентерийный, синегнойный, стафилококковый фаги и комбинированные препараты (колипротейный, пиобактериофаги и др.). Бактериофаги назначают по показаниям перорально, парентерально или местно в виде жидких, таблетированных форм, свечей или аэрозолей. Отличительной чертой фагов является полное отсутствие у них побочного действия. Однако лечебный и профилактический эффект фагов умеренный, поэтому их необходимо применять в комплексе с другими лечебными и профилактическими мероприятиями.

Бактериофаги широко применяют в генетической инженерии в качестве векторов для получения рекомбинантных ДНК.

8. Практика Методы культивирования вирусов. Характеристика, достоинства и недостатки биологических моделей.

Вирусы - облигатные внутриклеточные паразиты, не способные размножаться на искусственных питательных средах, поэтому для культивирования вирусов используют биологические модели:

• чувствительных лабораторных животных;

• куриные эмбрионы;

• культуры клеток (тканей).

Лабораторных животных в настоящее время применяют для культивирования вирусов, не размножающихся в культурах клеток и куриных эмбрионах. Для культивирования в зависимости от тропизма вирусов используют мышей, кроликов, хомячков, а также, если культивирование вирусов затруднено, возможно заражение приматов. Чаще используют молодых животных, а также новорожденных как наиболее восприимчивых. Вируссодержащий материал обычно вводят интрацеребрально, интраназально, per os и другими способами. При этом иногда можно воспроизвести модель инфекционного процесса, наблюдать некоторые клинические симптомы.

В куриных эмбрионах способно культивироваться большое количество разнообразных вирусов. Вируссодержащий материал вносят на хорион-аллантоисную оболочку, в аллантоисную или амниотическую полость, в желточный мешок 10-12-дневного оплодотворенного эмбриона. Заражение можно проводить открытым и закрытым способами в строго стерильных условиях (в специальном боксе, стерильными инструментами, с соблюдением правил асептики).

Этапы заражения куриного эмбриона

1. Перед заражением яйцо просматривают на овоскопе, карандашом отмечают на скорлупе границы воздушного мешка. Затем эмбрион помещают на специальную подставку, скорлупу протирают спиртом и настойкой йода.

2. При открытом способе заражения скорлупу аккуратно срезают ножницами чуть выше границы воздушного мешка, затем с помощью шприца или пастеровской пипетки вносят вируссодержащий материал на хорионаллантоисную оболочку или в соответствующую полость. После заражения отверстие в скорлупе закрывают стерильным стеклянным колпачком и заливают расплавленным воском для создания герметичных условий.

3. При закрытом способе заражения в скорлупе делают небольшое отверстие, через которое в вертикальном направлении на глубину 2 см вводят в аллантоисную полость иглу шприца. Для заражения в амниотическую полость яйцо помещают горизонтально.

4. После заражения отверстие в скорлупе заливают парафином.

5. Эмбрион помещают в термостат при температуре 37 °С.

6. Затем проводят индикацию и идентификацию вирусов.

Для культивирования вирусов используют также тканевые и клеточные культуры, полученные из эмбриональных и опухолевых клеток, так как они способны к быстрому росту. Для разрушения межклеточных связей в тканях используют трипсин и другие протеолитические ферменты. Культуры клеток могут быть одно- и многослойными. Культуры клеток разделяют:

• на первичные, размножающиеся только в первых генерациях (выдерживают только 5-10 пассажей);

• перевиваемые (стабильные), способные размножаться в лабораторных условиях длительное время;

• полуперевиваемые, имеющие определенную продолжительность жизни (40- 50 пассажей).

Культуры клеток помещают в специальные плоские сосуды - «матрацы» или в пробирки. Для культивирования клеток необходимы питательные среды, содержащие все необходимые элементы для жизнедеятельности и роста клеток (белки, углеводы, липиды, минеральные соли, витамины и др.), а также индикатор для контроля за пригодностью питательной среды и размножения вирусов (цветная проба) - среда 199, среда Игла, раствор Хенкса и др. Зараженные культуры клеток помещают в термостат и инкубируют в течение времени, необходимого для репродукции вирусов. Для обнаружения размножения вирусов в биологических моделях используют методы индикации вирусов в культуре клеток. При культивировании в организме лабораторных животных отмечают изменения в состоянии зараженного объекта, возможные симптомы развития инфекционного процесса, а также патологоанатомические изменения. Возможна постановка реакции гемагглютинации. Агглютинация эритроцитов происходит в жидкой среде (например, сыворотке крови животного) под действием гемагглютинина вирусов.