Факторы патогенности.
Основными факторами патогенности сибиреязвенного микроба являются капсула и трехкомпонентный экзотоксин, состоящий из фактора отека (ФО), протективного антигена (ПА) и летального фактора (ЛФ).
Капсула сибиреязвенного микроба синтезируется при прорастании спор в восприимчивом организме (или на специальных питательных средах) и защищает образующиеся вегетативные клетки от фагоцитоза. Синтез капсулы определяется генами (capA, capB, capC), расположенными на плазмиде рХО2.
Экзотоксин сибиреязвенного микроба имеет белковую природу. Он состоит из трех компонентов: фактора отека или эдематогенного фактора (ФО), летального фактора (ЛФ) и протективного антигена (ПА). Экзотоксин синтезируют как капсульные, так и бескапсульные клетки сибиреязвенного микроба. Синтез сибиреязвенного токсина определяется генами (cya, pag, lef), локализованными на плазмиде рХО1.
Некоторые авторы к факторам патогенности возбудителя сибирской язвы относят протеолитическую активность микроба. Гены, ответственные за протеолитическую активность сибиреязвенного микроба, локализованы на бактериальной хромосоме.
Источник и механизмы заболевания.
Резервуаром для сибиреязвенного микроба является инфицированная почва, в которой сибиреязвенный микроб сохраняется в споровой форме, формируя неблагополучные пункты.
Источником инфекции для человека являются больные животные (крупный рогатый скот, лошади, свиньи, олени, овцы и др.), инфицированные продукты питания и кожевенно-меховое сырье, полученное от больных животных. Возможно также заражение человека через инфицированную почву или загрязненные инфицированной почвой предметы. Больные животные выделяют бациллы с фекалиями, мочой, слюной, кровянистым отделяемым. Особенно много микробов в кровянистой пенистой жидкости, вытекающей из естественных отверстий агонизирующих животных в последние минуты жизни и в первые часы после смерти.
Пути заражения человека сибирской язвой – контактно-бытовой (уход за больными животными, переработка шерсти, шкур, кож, земляные работы), алиментарный (употребление в пищу мяса больных животных), воздушнопылевой (вдыхание спор). Человек заражается при уходе за больными животными, во время убоя больного животного, при переработке продуктов животного происхождения и кожевенного сырья, при употреблении инфицированного мяса или других продуктов животноводства.
Микробиологическая диагностика.
Материалом для исследования от больных людей является содержимое карбункула или язвы, струп, кровь, моча, мокрота, испражнения, рвотные массы. При патологоанатомическом исследовании забирают кровь, экссудаты, кусочки органов. По эпидемическим показаниям исследуют материал от животных, почву, фураж, воду, продовольственное сырье и продукты животного происхождения, кожевенное сырье (шерсть, щетину, шкуры).
Бактериоскопическое исследование проводится для выявления в исследуемом материале возбудителя. При этом используются разные методы окраски: окраска по Граму – для выявления вегетативных клеток, окраска по БурриГинсу, Ребигеру, Михину, Ольту, Гинсу, Романовскому-Гимзе, синькой Лёффлера – для обнаружения капсулы, окраска по Ожешко – для обнаружения спор, сибиреязвенной люминесцирующей сывороткой (антисоматической или антиспоровой, в зависимости от вида пробы) – для выявления возбудителя. При бактериоскопическом исследовании материала от больного обнаруживаются капсульные вегетативные клетки. Исследование на подвижность проводят микроскопическим методом раздавленной капли. Возбудитель сибирской язвы неподвижен. РИФ с сибиреязвенной люминесцирующей сывороткой является одним из методов экспресс-диагностики сибирской язвы. Для люминесцентной микроскопии мазки готовят из патологического материала, из подозрительных колоний, из материала, взятого от биопробных животных. На высохшие и фиксированные мазки наносят сибиреязвенные люминесцирующие адсорбированные иммуноглобулины. Этим методом можно выявить в пробах сибиреязвенные микробы в споровой или вегетативной форме. При наличии в пробе вегетативных клеток обнаруживаются палочки, окруженные ободком зеленоватого. Обнаружение в мазке из материала от больного (трупа) крупных грамположительных палочек, окруженных капсулой, позволяет поставить предварительный диагноз сибирской язвы.
Бактериологическое исследование направлено на выделение чистой культуры и ее идентификацию для окончательного подтверждения диагноза. Для посева исследуемого материала используют МПА и МПБ. Пробы, контаминированные посторонней микрофлорой, высевают на питательные среды с полимиксином В, лизоцимом, ЭДТА и ацетатом таллия. Посевы инкубируют при 36-37С в течение 18-24 часов.
Чистую культуру пересевают на скошенный МПА и инкубируют при температуре 37С в течение 4 суток для получения споровой культуры. Идентификацию выделенной культуры проводят на основании изучения характера роста микроба на питательных средах, подвижности, капсулообразующей способности, теста жемчужного ожерелья, чувствительности к бактериофагу. Дополнительно определяют лецитиназную, фосфатазную и гемолитическую активность культуры.
Капсулообразующую способность изучают на МПА с 0,7% бикарбоната натрия, на МПА с сывороткой крови крупного рогатого скота. Посевы инкубируют в течение 24-48 часов при 37ОС в атмосфере 5-10% углекислого газа. Посевы культуры для выявления капсулы можно производить в жидкую среду ГКИ (инактивированная сыворотка крови в растворе Хенкса). В сомнительных случаях капсулообразование выявляют путем заражения лабораторных животных. Через 1-2 часа животных забивают, из перитонеальной жидкости и крови готовят мазки, а из селезенки и печени – мазки-отпечатки. Препараты окрашивают для выявления капсулы и микроскопируют.
Лецитиназную активность проверяют на агаре с добавлением куриного желтка или в жидкой желточной среде. Сибиреязвенный микроб не свертывает желток в жидкой среде в течение нескольких суток. При росте на плотной среде вокруг колоний сибиреязвенного микроба мутная белая зона не образуется, так как возбудитель сибирской язвы не обладает лецитиназной активностью.
Фосфатазную активность проверяют на питательном агаре, содержащем фенолфталеинфосфат натрия. Посевы на этой среде инкубируют при 37ОС в течение 18-24 часов. Перед просмотром посевов в крышку чашки вносят раствор аммиака и через 1 минуту учитывают результаты. Под действием паров аммиака происходит окрашивание в розовый цвет колоний микроорганизмов, обладающих фосфатазной активностью. Сибиреязвенный микроб фосфатазной активностью не обладает, поэтому его колонии остаются бесцветными.
Гемолитическую активность проверяют при посеве исследуемой культуры на кровяной агар (3-5%) или в бульон с кровью. Результаты учитывают через 16-20 часов инкубирования посевов в термостате при 37ОС. Возбудитель сибирской язвы гемолитической активностью не обладает, поэтому вокруг колоний зоны гемолиза не образуется.
Сибиреязвенный микроб лизируется специфическими бактериофагами (Гамма-фаг, К-ВИЭВ, Саратов, ВА-9 и другие). Проба с бактериофагами проводится на плотной питательной среде путем нанесения капли суспензии бактериофага на предварительно высеянную культуру. Можно использовать также метод стекающей капли, при котором после нанесения капли суспензии бактериофага чашку наклоняют. Капля суспензии бактериофага при этом стекает по поверхности агара. Результат исследования в виде стерильного пятна или фаговой дорожки (отсутствие роста культуры) обнаруживается через 18-24 часа инкубирования при температуре 36С.
Биологическая проба. Для выделения чистой культуры, особенно из загрязненного материала, используют также лабораторных животных (морских свинок, белых мышей). Исследуемый материал вводится подкожно (морским свинкам – в паховую область, белым мышам – в корень хвоста). Мышам вводят по 0,2-0,5 мл, свинкам – по 0,5-1,0 мл. Морские свинки обычно погибают через 2-4 суток, а белые мыши – через 1-2 суток. При наличии сибиреязвенного микроба у лабораторных животных отмечается характерная патологоанатомическая картина: отек в месте введения материала, темная не свернувшаяся кровь, кровоизлияния в клетчатке, рыхлая селезенка. В мазках-отпечатках из внутренних органов и в препаратах, приготовленных из крови, обнаруживаются грамположительные палочки, окруженные капсулой.
Серодиагностика. Для определения антител в сыворотке крови больного применяют реакцию латексной агглютинации или РПГА с протективным сибиреязвенным антигеном. Сибиреязвенные антигены можно выявлять в РИФ, ИФА, РСК, РНГА, РП в геле и в реакции термопреципитации по Асколи.
Реакция термопреципитации по Асколи чаще всего используется для выявления сибиреязвенного возбудителя или соматического полисахаридного антигена в различных субстратах (кожевенном сырье, изделиях из кожи и шерсти, мясе, почве, испражнениях). Эта реакция позволяет определять наличие сибиреязвенного антигена как в свежем, так и в разложившемся сырье или мумифицированных трупах животного. Она позволяет обнаружить антигены возбудителя при отрицательных результатах бактериологического исследования. Компонентами этой реакции являются экстракт исследуемого материала и преципитирующая сибиреязвенная сыворотка. Перед постановкой реакции свежий материал предварительно выдерживают в термостате в течение 18-20 часов. Несвежий материал экстрагируют без выдерживания в термостате. Для приготовления экстракта материал заливают физиологическим раствором, кипятят в течение 10-45 минут и фильтруют. Иммунную преципитирующую сыворотку (0,2-0,3 мл) вносят в специальную узкую преципитационную пробирку и на нее осторожно наслаивают равное количество исследуемого экстракта. На границе соприкосновения компонентов в течение 1-5 минут образуется мутное кольцо преципитации белого цвета, что расценивается как положительный результат.
Аллергологическое исследование. Для ретроспективной диагностики сибирской язвы используется кожная аллергическая проба с антраксином. Антраксин вводят внутрикожно в ладонную поверхность предплечья в объеме 0,1 мл. Результат учитывают через 24-48 часов. Пробу считают положительной при наличии гиперемии и инфильтрата диаметром более 15 мм.