Пропитывние фиксатором или проникновение фиксатора в ткань
Формулы, показывающие глубину проникновения формалина в ткани.
Формулы
|
|
d k |
|
|
|
Medavar |
|
t |
|
||
|
|
|
|
|
|
(1941) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
d 2k |
|
1.56 |
|
|
|
Buesa |
|
t |
t |
|
|||
(2008) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Примечания
Печень 0.78, Яичный альбумин 3.6,
Свертки плазмы 5.5 – нет клеточных мембран
К – 0.78 для большинства тканей
Учтено проникновение с двух сторон
Показатели проникновения и уровни связывания формальдегида
|
|
Проникновение |
|
Уровень связывания |
|||||
|
|
|
(% толщины) |
|
|||||
Часов в 10% |
|
|
|
|
|
||||
Толщина ткани (мм) |
(% равновесия) |
||||||||
нейтральном |
|||||||||
забуференном |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
формалине |
1 |
|
2 |
3 |
4 |
5 |
25oC |
37oC |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1 |
100 |
|
78 |
52 |
39 |
31 |
5 |
10 |
|
2 |
|
|
100 |
73 |
55 |
44 |
10 |
21 |
|
4 |
|
|
|
10 |
78 |
62 |
20 |
40 |
|
|
|
|
0 |
||||||
8 |
|
|
|
|
10 |
88 |
39 |
68 |
|
|
|
|
|
0 |
|||||
12 |
|
|
|
|
|
10 |
57 |
87 |
|
|
|
|
|
|
0 |
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
||
18 |
|
|
|
|
|
|
81 |
100 |
|
24 |
|
|
|
|
|
|
100 |
|
|
Фиксация: Миф 4 При нагревании формалин быстро фиксирует
При нагреве тканей в формалине любым способом происходит быстрая фиксация.
Фиксация тканей формалином – химическая реакция и происходит за 24 час при комнатной температуре или за 16 часов при 37оС.
Формалин связывает молекулы белков перекрестными связями.
При нагревании выше 50оС начинается фиксация коагуляцией (температурное сворачивание белков). Это уже соврешенно другой механизм фиксации и в этом случае невозможно будет проведение большинства ИГХ-окрасок!
Фиксация: Миф 5 Ускорение фиксации вакуумом
В процессоре под вакуумом фиксация происходит быстрее.
Фиксация не ускоряется под вакуумом. Вакуум ускоряет пропитывание тканей.
Высокое давление немного ускоряет фиксацию, но оно должно быть очень высоким, и не достижимо в условиях обычной лаборатории.
Диапазон фиксации и температура
Связывание происходит быстрее при
1температуре 37оС, чем при 25оС.
Нагревание до 60оС или даже кипячение имеют эффект коагуляции, а не фиксации
Нагревание до 50±5оС микроволнами 3 дискутабельно, важна предварительная
полная пропитка ткани формалином.
При подогреве до 40оС в вакуумном процессоре время фиксации может быть сокращено до 18 часов
2
4
Равновесное
связывание
формалина
тканями
Fox CH, Johnson FB, Whiting J, Roller PP: Formaldehyde fixation.
J Histochem Cytochem, 1985; 33(8):845-853
Фиксация: Миф 6 Можно фиксировать в малом объеме формалина
Кассеты должны быть покрыты фиксатором
Внутренние размеры кассеты 25 х 32 х 4.8мм. Она должна быть заполнена до 75% объема (если это соскоб).
Кусочек должен свободно располагаться в кассете, т.е. размер его не должен превышать 20 х 28 х 3 мм.
Соотношение фиксатор:ткань не должно быть меньше 10:1, т.е., на каждую кассету потребуется не меньше 16.8 мл фиксатора. Общий объем: кассета + кусочек + фиксатор = 20 мл.
Или можно поместить в 0.5л банку - 25 кассет В 0.75 л банку– 38 кассет В 1 л банку – 45 кассет В 3л баллон – 135 кассет
Для эндобиоптатов это количество избыточно, но кассеты действительно должны быть погружены в фиксатор.
Фиксация: Миф 7 Достаточно одной смены формалина
Достаточно одной смены фиксатора.
Чаще материал в отделение приходит уже в формалине. Фрагменты толще 3 см даже после недели пребывания в формалине успевают только пропитаться фиксатором. После вырезки заметна неполная фиксация объектов (нет равномерно
серого цвета на разрезе). Поэтому материал в кассетах заливается свежей порцией формалина. После 24 часов ткани готовы для проводки.
Перед проводкой нужно отмыть избыток фиксатора из кассет: 30 минут в проточной воде.
Этапы воздействия формалина на ткани
Фиксация
Перекрестное
|
|
|
связывание |
|
|
Связывание |
|
|
|
разных белков |
|
|
|
|
|
|
|
Образование |
формалином |
|
|
|
|
|
|
ковалентной |
|
Пропитывание |
|
||
|
связи белка и |
|
|
|
|
|
|
Помещение |
|
||
|
формалина |
|
|
кусочка в |
|
|
|
формалин |
|
|
|
Фиксация
Окончание фиксации – ткань сжимается
Что происходит при фиксации?
Нейтрализация молекулы белка:
Образуется метиленовый мостик + 2 водородные связи и конгломерат молекул белка
Через 24-48 часов получается достаточно жесткий конгломерат и ткань в целом очень хорошо выдерживает воздействие химических и физических факторов, сохраняя морфологию.
Происходит сжатие ткани,
молекулы меньше движутся.
Микробные и эндогенные ферменты зависят от связей типа ключ-замок, следовательно распад
и аутолиз ингибируются.