Преимущества формалина
Долгое время используется (более 100 лет)
«Золотой стандарт» - фиксация формалином и заливка в парафин Максимум информации при низкой стоимости
Большинство антител оптимизированы «под формалин» Одобрен FDA
Сохраняет вторичную структуру белков Сохраняет липиды
Прост в обращении и хранении Основа для большинства научных статей и обучения патологов
Недостатки формалина
Канцероген Токсичный, аллергенный Медленно фиксирует
Плох для гибридизации in situ
Плох для ИГХ после длительного хранения Дорогостоящая процедура утилизации
Недостатки любого заменителя формалина
1. |
Запуск 25-100 параллельных образцов. Это |
|
|
|
относится к любому изменению в процедуре, для |
|
|
|
всех ИГХ-тестов и специальных процедур (любой |
|
|
|
тест одобрен FDA для фиксированных формалином |
|
|
|
и залитых в парафин тканей). (Требования CAP) |
|
4 |
2. |
Должен быть заменен весь набор контролей и |
|
|
|
перетестированы все рабочие разведения антител |
|
|
3. |
Если любой блок с заменителем будет послан на |
|
|
|
консультацию, достоверность результатов |
|
|
|
консультанта станет сомнительной |
3 |
|
4. |
Риск ответственности патолога и |
|
|
|
|
||
учреждения в юридическом плане
2
1
Рекомендации комитета по ИГХ- тестированию рецепторов эстрогена
Consensus Recommendations on Estrogen Receptor Testing in Breast Cancer By Immunohistochemistry
(Appl Immunohistochem Mol Morphol 2008;16:513–520)
Hadi Yaziji, Clive R. Taylor, D.Phil, Neal S. Goldstein,David J. Dabbs, Elizabeth H. Hammond, Bryan Hewlett, Alton D. Floyd, PhD,Todd S. Barry, Alvn W. Martin, Sunil Badve, Frederick Baehner,Richard W. Cartun, Richard N. Eisen, Paul E. Swanson, Stephen M. Hewitt, Mogen Vyberg, David G. Hicks, and Members of the Standardization Ad-Hoc Consensus Committee
•10% нейтральный забуференный формалин
•Кусочки ткани 2-3 мм толщиной
•24-48 часов
•Детальная запись времени взятия, начала фиксации, вырезки образца и последующей фиксации до проводки
•Избегать высоких температур при проводке
•Не передерживать ткани в горячем парафине
•Использовать рекомендованные клоны антител
Проводка ткани: Миф 1 Достаточно 2-3 смены дегидратанта
Тканям достаточно для обезвоживания 2-3 смен дегидратанта.
Это утверждение справедливо для эндобиоптатов. Им действительно достаточно 2 смены по 15 минут.
На самом деле большинство тканей содержат очень мало воды (кость, кожа, жир, фиброзная ткань)
Для обычных образцов нужно не меньше 5 смен по 1 часу.
Дегидратант удаляет не только несвязанную воду, но и часть жиров, а это очень важно для
адекватного пропитывания парафином (парафин жиры не растворяет!)
Последний дегидратант должен быть ВСЕГДА НОВЫМ. Первый выливается, остальные передвигаются на одну позицию влево.
Ни один дегидратант не должен быть мутным!
Сколько смен дегидратанта необходимо?
9% 16%,
2,8%
0,2% 0,02%
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
A |
|
B |
C |
|
D |
|
1 х 100 мл |
|
2 х 50 мл |
|
4 х 25 мл |
|
5 х 25 мл |
|
|
|
|
|
|
|
Фрагмент ткани, содержащий около 10 мл воды
Проводка ткани: Миф 2 Не важен тип дегидратанта
Любой дегидратант работает хорошо.
Да, все типы дегидратантов хорошо удаляют воду и жир из тканей. Но не в каждом можно оставить ткани на долгий срок (например, при поломке процессора).
Ацетон очень пожароопасен и сильно уплотняет ткани. Этанол сильно уплотняет ткани и нуждается в строгом учете. Сильно уплотненные ткани очень трудно резать на микротоме.
Выбор дегидратанта
Изопро- |
Ацетон |
Этанол |
панол |
X |
X |
Мягкий для тканей, безопасный для персонала, доступный на рынке, не пожароопасный.
Проводка ткани: Миф 3 Нагрев дегидратанта сокращает время проводки
Это действительно так. При повышении температуры на каждые 10оС скорость химических реакций увеличивается в 2-4 раза (правило Вант-Гоффа).
Однако при проводке материала, подлежащего ИГХ-окраске на рецепторы эстрогена важно не применять нагревание на всех этапах проводки, кроме парафина.
Имеются и другие молекулы, изменяющиеся при нагревании.
Проводка ткани: Миф 4 Не важен тип просветлителя
Любой просветлитель работает хорошо.
Просветлитель должен хорошо смешиваться как с дегидратантом, так и с парафином.
Ксилол делает ткани хрупкими при избыточном воздействии.
Многие просветлители токсичны для персонала
(нефро-, гепато-, репродуктивная токсичность, общие симптомы отравлений и аллергические реакции).
Стоимость – один из решающих критериев при работе с большими объемами исследований.
Необходимость перерыва на ночь при ручной проводке и защита от сбоев аппаратуры диктует поиск «мягкого» для тканей просветлителя.