- •1.Биотехнология как межотраслевая область научно-практических знаний.
- •2. Связи биотехнологии с рядом современных отраслей промышленных производств.
- •3.Основные факторы, обусловившие стимул в развитии современной биотехнологии.
- •4. Связь биотехнологии с биологическими, химическими, техническими и другими науками.
- •5. Практические задачи биотехнологии
- •6. Исторические этапы развития биотехнологии
- •7 Переход от эмпирического к научному подходу в решении б.Т. Задач
- •8)Экономические аспекты биотехнологии:
- •9. Ключевая роль биотехнологии в социально-экономическом развитии отдельных государств и в целом.
- •10. Области применения достижений биотехнологии
- •11.Продукты биотехнологических производств
- •12. Обобщенная схема биотехнологического производства.
- •14. Пути повышения рентабельности биотенологических производств.
- •15 Мелкомасштабная и крупномасштабная биотехн.
- •18. Способы очистки сточных вод.
- •19.Характеристика параметров “клеточных” процессов.
- •20. Характеристика параметров “метаболитических процессов”.
- •23 Микроорганизмы - основные объекты биотехнологии
- •24)Преимущества микроорганизмов перед другими объектами в решении современных биотехнологических задач:
- •25.Характеристика объектов биотехнологии.
- •26. Особенности использования эукариотических клеток в биотехнологическом производстве
- •27.Принципы подбора биотехнологических объектов.
- •28. Промышленные, модельные и базовые микроорганизмы.
- •29. Требования к продуцентам, используемых в биотехнологическом производстве.
- •30. Способы улучшения продуцентов
- •31) Уровни регуляции клеточного метаболизма и пути воздействия на него
- •2) Лактозный оперон, триптофановый
- •32) Физиологические и генетические способы регуляции метаболизма микроорганизмов-продуцентов.
- •2) Лактозный оперон, триптофановый
- •34. Регуляция на уровне транскрипции. Конечный продукт как регулятор биосинтеза
- •35. Роль внешних факторов в регуляции метаболизма продуцентов.
- •36. Понятие о продуцентах и сверхпродуцентах.
- •37. Использование генетических методов в биотехнологии.
- •40)Мутации изменяющие экспрессию генов на примере лактозного и триптофанового оперонов
- •42. Требования, предъявляемые к питательным субстратам, используемым в биотехнологических процессах
- •43. Сырье и питательные среды.
- •Среды, предназначаемые для ферментационных процессов
- •44. Основные типы питательных сред и принципы их выбора.
- •46. Природные сырьевые материалы растительного происхождения.
- •47.Продукты отхода различных произв-в, как сырье б.Т. Проц-в. Хим-е и нефтехим-е субстраты
- •49.Преимущества и недостатки биотехнологических производств по сравнению с химическими технологиями.
- •50. Принципиальные схемы биотехнологических процессов, определяющие конструктивные особенности биореакторов(ферменторов)
- •51.Основные требования, предъявляемые к системам, используемым для процессов ферментации
- •52. Общая схема ферментационных процессов.
- •53. Типы и режимы ферментаций: периодические и непрерывные п-сы.
- •54. Продукты первой и второй стадии ферментации
- •55 Взаимосвязь тропо- и идиофазы при получении первичных и вторичных метаболитов
- •56)Особенности роста и культивирования микроорганизмов в очистных сооружениях:
- •58. Особенности роста и культивирования микроорганизмов при производстве первичных и вторичных метаболитов
- •60. Открытые и замкнутые ферментационные системы.
- •61. Проблемы пеногашения при различных ферментациях.
- •62. Проблемы асептики, при различных ферментациях
- •64)Регулирование режима культивирование продуцентов по принципу хемостата:
- •65.Параметры роста при периодическом культивировании.
- •66. Продукты первой и второй фазы роста
- •67.Типы периодического культивирования.
- •68. Непрерывно-проточное культивирование.
- •69. Принцип подбора и конструирования биореактора.
- •70. Основные требования, предъявляемые к биореакторам
- •71.Системы перемещивания, примен-е в совр-х ферменторах
- •74. Специализированные ферментационные технологии: аэробные, твердофазные и газофазные процессы
- •75.Особенности культивирования клеток растений.
- •76. Особенности культивирования клеток животных.
- •78. Принципы подбора питательных сред для культивирования микроорганизмов, клеток животных и растений.
- •79 Конечные стадии получения продуктов биотехнологических процессов
- •80)Основные методы и принципы выделения продуктов биосинтеза
- •81.Методы отделения биомассы.
- •82. Пенообразование и пеногашение
- •83.Методы дезинтеграции клеток.
- •84. Выделение целевого продукта: осаждение, экстрагирование, адсорбция.
- •85. Электрохимические методы выделения целевого продукта, ионообменная хроматография, иммуноэлектрофорез.
- •86. Концентрирование, обезвоживание, модификация и стабилизация целевых продуктов биотехнологических процессов
- •88)Продуценты белка.Требования,предъявляемые к микробному белку и возможности его использования.
- •90. Принципиальная схема производственного процесса белка одноклеточных
- •91.Лимитирующий фактор и его роль в процессах непрерывного культивирования
- •92. Технология производства ферментов для промышленных целей. Требования, предъявляемые к продуцентам ферментов.
- •93. Иммобилизованные ферменты и преимущества применения в биотехнологии.
- •94. Носители, используемые для иммобилизации ферментов: природные и синтетические органические носители. Типы неорганических носителей.
- •95.Способы иммобилизации ферментов
- •96. Иммобилизованные клетки в биотехнологии:
- •97. Генетическая инженерия и биотехнология.
- •98. Генетическая инженерия и технология рекомбинантных молекул
- •99.Основные окрытия, теоретически обосновавшие технологический подход к наследственной информации.
- •100. Общие понятия о матричных процессах: репликация, транскрипция, трансляция.
- •101. Инструменты генетической инженерии
- •102. Принципы создания рекомбинантных молекул in vivo.
- •103. Поняте о репликоне. Основные типы репликонов
- •104)Рестрицирующие эндонуклеазы,их основные характеристики область применения
- •106. Способы идентификации фрагментов днк.
- •107.Требование к базовым штаммам в генной инженерии.
- •108. Характеристика e.Coli, как основного базового штамма в генной инженерии.
- •109. Особенности грамположительных бактерий при ги манипуляциях.
- •110.Гибридизационные зонды
- •111. Рестрикционное картирование генетических элементов
- •112)Соединение фрагментов днк:
- •113. Обратная транскриптаза и её использование в генной инженерии.
- •116. Использование линкерных полинуклеотидов в технологии клонирования днк.
- •117. Понятие вектора
- •118. Общие свойства векторов.
- •119. Специализированные векторные системы
- •120)Векторные системы,применяемые применяемые при молекулярном клонировании в клетках прокариотических организмов:
- •121. Типы векторов: плазмидные и фаговые векторы(в) природного и искусственного происхождения.
- •122. Клеточные генетические структуры способные выполнять роль векторов
- •123. Принципы конструирования векторов.
- •124. Требования к идеальному плазмидному вектору.
- •125. Свойства фага с точки зрения вектора для создания рекомбинантных молекул.
- •127 Фазмиды и их применение
- •128)Космиды и их применение
- •129. Упаковочная система фага лямбда.
- •130. Банки генов и клонотеки
- •131.Свойства нитевидных фагов, позволяющие им выступать в качестве векторов
- •132. Векторы на основе генома нитевидных фагов.
- •133. Особенности тарансформации грамотрицательных и грамположительных бактерий
- •134.Векторы для клонирования в грамположительных бактриях
- •135. Челночные векторы (бинарные)
- •136)Векторные системы для клонирования в клетках дрожжей:
- •138. Использование вирусных геномов в качестве векторов для введения генетической информации в клетки животных
- •139.Свойства вируса sv40 и векторов на его основе.
- •140. Природные векторы для растений.
- •141. Организация и «поведение» Ti- плазмиды.
- •143. Стратегия клонирования в грамположительных бактериях
- •144)Стратегия клонирования в дрожжевых клетках
- •145)Стратегия клонирования в клетках млекопитающих:
- •146. Старатегия клонирования в клетках растений
- •147.Экспрессия чужеродной генетической информации в клетках бактерий, дрожжей, растений и животных.
- •148. Особенности организации векторных систем для экспрессии генов.
- •149. Сложная структура организации эукариотических генов и их экспрессия в прокариотических клетках.
- •150. Получение продуцента человеческого гормона роста
- •154. Способы введения рекомбинантной Днк в клетки растений и животных
- •155.Методы культивирования клеток высших растений.
- •156. Каллусные и суспензионные культуры; методы получения и область использования.
- •157. Протопласты растительных клеток; способы получения, методы культивирования и регенерации.
- •158. Слияние протопластов растительных клеток и методы реверсии. Гибридизация соматических клеток растений.
- •159. Культивирование клеток и тканей
- •161.Необходимые условия для культивирования клеток животных. Конструктивные особенности биореакторов.
- •162. Моноклональные антитела и технология гибридом
- •163.Биотехнология и сельское хозяйство.
- •164. Использование биотехнологических подходов в растениеводстве и животноводстве.
- •165. Биотехнология и медицина. Применение моноклональных антител.
- •166. Энергетика и биотехнология. Биотехнологические способы получения энергоносителей.
- •167. Биотехнология и ос
- •168)Социальные аспекты биотехнологии и биоинженерии
76. Особенности культивирования клеток животных.
История метода
Признание идеи о том, что клетки тканей высших животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro, датируется первым десятилетием XX века. После того как стало известно, что подобные процессы реальны, наступил второй этап работ, начало которому положила демонстрация возможности выращивания и репродукции в таких клетках фильтрующихся инфекционных агентов—вирусов. Третий этап истории начинается со времени, когда была показана практическая возможность получения в клетках животных больших количеств вирусного материала для применения в вакцинных препаратах, и простирается до времени, когда: 1) стало возможным вставить в клетки специфические экзогенно полученные гены и получить их экспрессию и 2) подтверждена возможность выращивания в культуре из одиночной клетки целой популяции. Когда такие популяции получали из клетки, выделявшей в окружающую среду антитела, то все молекулы антител в надосадочной жидкости были одинаковыми. Причины и следствия этих двух феноменов в настоящее время интенсивно исследуются и они знаменуют собой начало четвертого этапа работ в данной области.
Чтобы показать способность клеток животных расти и делиться в культуре, потребовалось овладеть рядом подходов и методик. Особенности их приведены ниже.
1. Методики получения клеток, свободных от экзогенных прокариотов и грибов.
2. Методики разработки среды, в которых рост «вырезанных из ткани» или изолированных клеток не подавляется.
3. Методики наблюдения за клетками в динамике их развития.
4. Методики непрерывного культивирования культур клеток животных in vitro и поддержания их свободными от других биологических агентов.
Научную основу для разработки этих методик составляет представление о клетке как основном структурном элементе живых организмов животного и растительного происхождения. Идея о том, что клетки тканей животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro возникла на базе концепции, принадлежащей Клоду Бернару. Он предположил, что не только живые организмы способны сохранять постоянство внутренних условий, вне зависимости от изменений в окружающей среде. Клетка вне организма животного тоже будет стремиться поддерживать свои внутренние условия. Если различия между внутренними и внешними условиями будут незначительными, то высока вероятность роста и деления клетки. Такое понимание явления приводит к необходимости разработки сред, способных поддерживать и стимулировать рост клеток вне организма.
Существует 2 основных системы культивирования клеток.
1. Непроточные культуры - тип культур, в котором клетки вводят в фиксированный объем среды. По мере роста клеток происходит использование питательных веществ и накопление метаболитов, поэтому среда должна периодически меняться, что приводит к изменению клеточного метаболизма, называемого еще и физиологической дифференцировкой. Со временем, в результате истощения среды происходит прекращение пролиферации клеток.
Увеличить продолжительность жизни непроточных культур можно несколькими способами:
прерывистый (часть культуры заменяется равным объемом свежей среды);
постоянный (объем культуры увеличивается с постоянной низкой скоростью, а небольшие порции клеток периодически удаляются);
перфузионный (осуществляется постоянное поступление свежей среды в культуру и одновременное удаление равного объема использованной (бесклеточной) среды).
Перфузия может быть открытой, когда из системы удаляется вся среда, и закрытой, когда удаляемая среда проходит через дополнительный сосуд, где восстанавливается ее рН и осуществляется аэрирование, и возвращается в культуральный сосуд.
Все системы непроточных культур характеризуются накоплением отходов в той или иной форме и непостоянством внешних условий.
2. Проточные культуры обеспечивают истинные гомеостатические условия без изменения концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Гомеостаз обусловлен постоянным вхождением среды в культуру и одновременным удалением равного объема среды с клетками. Такие системы пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях.
Существует 2 крупных направления в культивировании животных клеток:монослойные культуры и суспензионные культуры.
Суспензионные культуры предпочтительнее с точки зрения увеличения выхода клеток.
Монослойные культуры также обладают рядом преимуществ:
1. Легко провести полную замену среды и промыть клетки перед добавлением свежей питательной среды. Это важно в тех случаях, когда рост клеток идет в одних условиях, а наработка продукта в других условиях, например при переносе клеток из среды с сывороткой в бессывороточную среду. Можно также полностью удалять нежелательные компоненты.
2. Позволяют обеспечить высокую плотность клеток.
3. У многих клеток экспрессия требуемого продукта идет эффективнее, если клетки прикреплены к субстрату.
4. Монослойные культуры могут быть использованы для любого типа клеток, что обеспечивает наибольшую гибкость исследований.
5. В некоторых случаях, например для распространения вирусов, требуются тесные межклеточные контакты.
Недостатками монослойных культур являются:
требования большого пространства;
возрастание стоимости и трудоемкости при увеличении масштаба;
недостаточно эффективный контроль, обусловленный трудностями отбора пробы;
сложности в определении и контролировании рН, концентрации кислорода.
Необходимо отметить, что применение микроносителей устраняет эти недостатки. Существует много различных разновидностей этого способа культивирования. Рассмотрим три основных направления:
1. Культивирование в плоских флаконах (матрацах).
2. Культивирование во вращающихся бутылях, когда в каждый момент времени 1520% поверхности бутыли покрыто питательной средой, а клетки находятся попеременно то в среде, то в воздухе.
3. Культивирование в колонках на микроносителях, в качестве которых выступают плотно упакованные, не смещающиеся стеклянные бусы диаметром 35 мм, стопка пластин и др., а питательная среда омывает их, протекая сверху вниз.
77. Технология культивирования клеток животных. Параметры роста.
Массовое культивирование организмов для биотехнологических целей достаточно хорошо разработано применительно к бактериям, дрожжам и мицелиальным грибам, и лишь сравнительно недавно начались интенсивные исследования в области выращивания культур клеток животных и растений.
Потенциально очень важные органические соединения синтезируются только растительными или животными клетками, что заставляет изыскивать подходы в решении возникающих проблем, не обращая существенного внимания на стоимость этих технологий.
Клетки животных способны расти либо в виде суспензий, либо прикрепленными к плотному субстрату (твердой поверхности). Такие клетки как, HeLa (клетки, происходящие из опухоли человека) могут расти в любом из этих состояний; лимфобластомные клетки растут в суспендированных культурах; а нормальные диплоидные клетки способны расти только будучи прикрепленными к твердой поверхности. Монослойное культивирование животных клеток во многом определяется доступностью поверхности для их прикрепления, вследствие чего многие конструкторские разработки направлены на создание методов увеличении возможной площади прикрепления. Ранние технологии основывались преимущественно на использовании вращающихся пробирок или флаконов с целью лучшего обеспечения растущих клеток питательными веществами и воздухом.
Создаваемые в последнее время системы предназначаются для поддержания роста клеток на свернутых в виде "бухт" проницаемых для газов тефлоновых трубочках, каждая из которых имеет поверхность около 10 000 см (а общее их число в реакторе более 20). В таких условиях многие типы клеток культивируются довольно хорошо. Еще одним перспективным способом культивирования клеток животных является способ, основанный на использовании небольших бусин (шариков, микроносителей), к которым прикрепляются клетки. Шарики могут изготавливаться из сефадекса и обладать поверхностью в 7 см на 1 мг. Шарики способны плавать в суспендированном состоянии и на них могут расти клетки различных типов. Таким путем уже получают человеческий интерферон. Данный способ, полагают, способен заменить метод монослойных культур.