159. Культивирование клеток и тканей

Ткани- сообщества связанных между собой клеток.

1907г.- впервые культивирование тканей- Харисон- нервная ткань лягушки.

Культуры тканей используются в медицинских и биотехнологических исследованиях.

Проблемы:

1. Гл. проблема- питательные среды. Они должны содержать все необходимые растениям и животным компоненты: НК, витамины, источник «С» и энергии.

2. Контаминация- попадание нестерильных элементов.

3. Особенно кл.животных должны контактировать с какой-л поверхностью- вырастают в виде монослоя. В жидкой среде могут расти клетки крови, лимфы.

1955- Игл придумал 1 питательную среду для культивирования кл.животных. Вода обычно дистиллированная, соли, кислоты, витамины, антибиотики. Добавил телячью сыворотку (из крови не родившихся телят). Важный момент- поддержание рН 7,2-7,4, снабжение кислородом.Клетки животных способны расти либо в виде суспензий, либо прикрепленными к плотному субстрату (твердой поверхности). Такие клетки, как HeLa (клетки, происходящие из опухоли человека), могут расти в любом из этих состояний; лимфобластомные клетки растут в суспендированных культурах, а нормальные диплоидные клетки способны расти только будучи прикрепленными к твердой поверхности. Монослойное культивирование животных клеток определяется доступностью поверхности для их прикрепления, вследствие чего многие конструкторские разработки направлены на создание методов увеличения возможной площади прикрепления. Крупномасштабное культивирование животных клеток в монослое нацелено на получение наибольшей концентрации клеток в наименьшем объеме газовой фазы.Прикрепившиеся клетки размножаются, растут и развиваются до тех пор, пока не сольются в монослой, то есть плотность клеток выступает тормозным сигналом. Однако при смене питательной среды на новые порции наблюдается дальнейшее разрастание клеток в форме нескольких слившихся слоев. Такого результата можно добиться при использовании других факторов воздействия на клеточные культуры (гормоны, ферменты, рН и т. д.). На практике широко пользуются монослойными культурами.Рост клеток в виде монослоя зависит от адгезивных белков- фибронектинов(от лат. fibra — нить, nectere — связывать или соединять), обеспечивающих межклеточную адгезию, прикрепление клеток к подложке и направляющих их перемещения. на. При доступности донорской ткани используют клетки почек кроликов, обезьян, собак (линия МДСР), 10—14-дневных куриных эмбрионов, клетки из миндалин, амниона, легких эмбриона человека 12—16-недельного возраста, клетки эпидермиса взрослого человека и другие.

Во время цикла культивирования клеток должны учитываться разные параметры: Константные- качество материала, форма и объем культиватора, вариабельные— скорость вращения или покачивания, качество и объем среды, тип клеток и размер (величина) посевного материала, рН и температура среды, снабжение кислородом и содержание С02 в культиваторе, окислительно-восстановительный потенциал и концентрация основных источников питания. Оптимальные показатели рН и температуры зависят от происхождения и качества клеточных линий. Так, для клеток млекопитающих концентрацию водородных ионов поддерживают в пределах рН от 7,2 до 7,4, а температуру — в пределах + 36—+ 37,5°С. Поддержание рН осуществляют обычно за счет буферных систем, а температуру— с помощью терморегуляторов.

Контроль за развитием клеток проводят с помощью прямых (подсчет) и непрямых методов (по мутности, по подсчету ядер, по определению общего белка).

Глубинное выращивание клеток в суспензионных культурах.

Площадь выращиваемых клеток можно существенно увеличить при использовании микроносителей, суспендируемых в питательной среде и на поверхности которых клетки закрепляются,а затем разрастаются в виде монослоя. Такие суспендированные микроносители с клетками моделируют глубинные культуры, например,микроорганизмов. Следовательно, в таких системах совмещаются монослойные и суспензионные культуры животных клеток. Клетки после выращивания отделяют от микроносителей центрифугированием (в том числе в градиенте плотности), фильтрованием, или, обработкой трипсином с последующими промыванием и сепарированием. Суспензионные клетки на микроносителях применяют в целях получения вирусных вакцин (против бешенства, полиомиелита, ящура). Клеткам животных в глубинных культурах .почти во всех случаях требуется защитная матрица(белки сыворотки крови, добавляемой в среду культивирования).