144)Стратегия клонирования в дрожжевых клетках

Работа с дрожжами облегчается тем, что подобно бактериям они могут расти в жидкой среде и давать колонии на твёрдой среде,такие имеют сравнительно короткое время регенерации вследствии малого размера генома.Выделение ДНК:удаляют целлюлозную клеточную стенку ферментами,получают сферопласты ,их инкубируют с ДНК в присутствии полиэтиленгликоля.Мембрана становится проницаемой для ДНК. Затем инкубация в сферопластов в среде с агаром восстанавливает клеточную стенку.Селекция дрожжевых клонов основана на применении в качестве клеток-хозяев определённых мутантов ,не способных расти на среде,в которой отсутствует тот или иной питательный компонент.Векторна я плазмида содержит гены, которые при попадании в клетку хозяина придают ей этот недостающий признак

145)Стратегия клонирования в клетках млекопитающих:

Предварительно клонированные гены вводят в клетку животных различными путями.Суть одного из них состоит в трансформации клеток требуемым геном ,соеденённым одним из генов ,для которых осуществляется селекция.Метод маркера:селективные маркеры дают возможность вводить в клетки млекопитающих любой ген,заранее лигированный с клонированным селективным маркером.Для трансформации клеток животных были использованы гибриды бактериальных плазмид с геном ТК(фермент тимидинкиназа) из вируса герпеса.Для этого предварительно проводили клонирование и идентификацию генов в клетках Е.коли. и затем полученная рекомбинантная плазмида вводилась в ТК- клетки.

146. Старатегия клонирования в клетках растений

Легче культивировать в жид среде. Растения перестают быть автотрофами, им необходимы фитогормоны, кислород.

Получают гормоны, лекарства, красители, инсектециды. Вкусовые добавки

Этапы культивирования:

• Взять растение

• Получить отдельные клетки, подействовав на них ферментами пектиназой, целлюлазой

• Лишить клетки клет. Стенки и получение протопластов . Их можно культивировать

• Регенерация протопластов

• Деление протопластов

• Образование каллусов

• Воздействие фитогормонов и образование побегов из каллуса и получение нормального растения

К ультура кл

Б иомасса культуральн жидкость

Дезинтеграция

Г омогенат клеток

О тделение продукта

Концентрирование

Обезвоживание

Стабилизация

Целевой продукт

Предварительная обработка – действия улучшающие культуру клеток (изменен п-аш, воздействие температуры, добавление активных белковых компонентов)

Способы:

Флотация – если клетки плохо смачиваются и накапливаются в верхнем слое. Чаще используются для отделения дрожжевых клеток. Преимущества : экономические , высокая продуктивность

Фильтрация: применен различных фильтров. Метод задержания биомассы, но пропуск жидкость. Недостаток6 быстрая забиваемость фильтров.

Центрифугирование: осаждение взвешенных частиц в центрифугах. Требует сложного оборудования. Используют , если культура оседает или всплывает медленно

Разрушение клеточные стенок.

Физические: ультразвук, замораживание-оттаивание, мельницы, прессы,

Химические: детергенты, обработка кислотой, экстракция ацетоном, лиофилизация

Биологические: ферменты, фаги, агенты игибирующие синтез клет стенок

Стабилизация: В 90% случаев обезвоживание, приводят к стабилизации, Химич способы, сушка, добавление антиокислителей, В рез. Получ продукт в сухом виде. Далее важно хранение и применение.