книги / Основы взаимодействия ультразвука с биологическими объектами

В связи с этим необходимо отметить, что общепринятый метод оп­ ределения жизнеспособных и мертвых клеток по окрашиваемости по­ следних трипановым синим или другими красителями не всегда приго­ ден для клеток, подвергнутых ультразвуковому воздействию. Сразу по­ сле ультразвукового облучения клетки могут легко окрашиваться из-за повышенной проницаемости мембран, но через 20...50 мин окрашивае­ мых клеток оказывается примерно столько же, сколько и в контроль­ ном образце, не облученном ультразвуком.

Другие процессы, развивающиеся в клетке после ультразвукового воздействия, имеют выраженный характер биологического ответа на внешнее возмущение.

Клетки тромбоцитов, например, подвергнутые ультразвуковой об­ работке (1 МГц; 0,2...0,6 Вт/см2; 5 мин), на электронных микрофото­ графиях не отличаются от контрольных и функционируют как ин­ тактные. Однако через 30 мин инкубации при 22 °С в контрольных и облученных ультразвуком клетках возникают заметные функцио­ нальные и морфологические различия. Время рекальцификации тромбоцитов, мало изменяющееся в процессе ультразвуковой обра­ ботки (1 МГц; 0.065...2 Вт/см2, 5 мин), необратимо снижается в тече­ ние 4...6 ч после облучения.

Обратимое снижение электрокинетического потенциала клеток лимфомы мышей можно наблюдать в течение 40...48 ч после ультра­ звукового воздействия (2 МГц; 10 Вт/см2 5РТА-, 5 мин).

Ультразвуковое воздействие на клетки в суспензии или в культуре в зависимости от параметров ультразвука и условий облучения может обусловить как стимуляцию, так и подавление процессов их жизне­ деятельности.

В относительно мягких условиях ультразвуковой обработки (1...5 МГц; 0,2... 1 Вт/см2; 5 мин; импульсный режим) наблюдаются про­ цессы стимулирования синтеза соединительного белка в клетках куль­ туры фибробластов, интерферона в лейкоцитах и т. д. Увеличение ин­ тенсивности ультразвука приводит к угнетению биохимических про­ цессов в клетках, к уменьшению числа клеток в культуре, причем наиболее выраженное угнетение наблюдается на частоте 1 МГц.

При невысоких (терапевтических) интенсивностях ультразвука эффект стимулирования синтеза белка наблюдается и в тканях тепло­ кровных.

Так, 3-4 сеанса облучения ультразвуком (3 МГц; 0,5 Вт/см2; 5 мин) вызывают в тканях уха кролика, поврежденного криохирургическим инструментом, заметное ускорение синтеза коллагена. Этот эффект ле­ жит в основе ультразвуковых методов ускорения заживления ран.

Ускорение биохимических процессов в клетке приводит к повы­ шению ее физиологической активности, к увеличению сопротивляе­ мости внешним воздействиям.

Клетки костного мозга, облученные ультразвуком (0,8 МГц; 0,3...0,7 Вт/см2; 20 мин) и введенные контрольным животным, дают на­ чало большему числу колоний на поверхности и в паренхиме селезен­ ки. Колонии растут быстрее, ускоряется и дифференциация колоний.

Бродильная активность дрожжей после обработки ультразвуком (425 кГц; 0.5...5 ч) увеличивается на 12...15 %, а количество клеток в облученной ультразвуком (0,8 МГц; 2,5 Вт/см2; 5 мин) суспензии бы­ стро увеличивается.

Обработка ультразвуком (0,9 и 2,6 МГц; 0,5...1,2 Вт/см2; 10 мин) несколько снижает число жизнеспособных клеток костного мозга в суспензии. Однако уже после нескольких суток хранения при 4°С в облученных ультразвуком образцах остается значительно больше жизнеспособных клеток, чем в контрольных образцах. Время разру­ шения половины клеток костного мозга в суспензии увеличивается после ультразвукового воздействия практически вдвое - с 5 до 9 дней, что позволяет при хранении уменьшить потери клеток, пригодных для трансплантации.

Увеличение интенсивности ультразвука до значений, превы­ шающих 1...1,5 Вт/см2, приводит, как правило, к подавлению биологи­ ческих функций клеток. Непрерывный ультразвук (1 и 2 МГц; 0,8...2,6 Вт/см2; 60 мин) подавляет скорость роста амниотических кле­ ток в культуре, причем порог подавляющего действия лежит между 0,8 и 1,7 Вт/см2.

Между областями явного стимулирования и явного подавления лежит область, где наблюдается суперпозиция этих эффектов. Так, клеткам асинхронной культуры ткани китайского хомячка после ульт­ развуковой обработки (1 МГц; 2,5 Вт/см2 5РТА\ 1 мин) предоставили возможность роста в монослое. В первые 24 ч роста не наблюдалось. Затем обнаружился рост, и к 35-му часу скорость роста нормализова­ лась. В данном случае остановка роста в первые 24 ч объясняется при­ мерным равенством гибнущих и пролиферирующих клеток в среде.

Обычно клетки животных тканей в культуре хорошо переносят ультразвуковое облучение, если исключаются кавитация или нагрев. Выжившие клетки, как правило, способны к нормальному росту и раз­ витию, хотя образованные ими колонии нередко не достигают разме­ ров, характерных для колоний, возникших из необлученных ультра­ звуком клеток.

3.3.3. Ультразвуковое воздействие на деление клеток

Временное ингибирование некоторых функций организма и отда­ ление периодов наибольшей активности важнейших из них является общей реакцией организма и отдельных его систем на внешнее повре­ ждающее воздействие. Особенно часто этот феномен проявляется в

задержке клеточного деления в некоторых тканях в ответ на повреж­ дающие, активирующие или сигнальные воздействия. Действие ульт­ развука также временно уменьшает скорость деления клеток.

На клетках мерисистемы корней гороха показано, что непрерыв­ ный ультразвук (2 МГц; 0,5...20 Вт/см2; 1 мин), как и импульсный сходных параметров, вызывает уменьшение скорости роста корня, уменьшение митотического индекса, снижение скорости синтеза белка, ДНК и РНК. Интересно отметить, что, в основном, эффект возникает в первые секунды облучения, а затем лишь незначительно увеличивается.

Животные ткани более чувствительны к ультразвуку, и скорость деления клеток в них уменьшается при весьма малых интенсивностях ультразвука. Так, пятиминутное облучение ультразвуком интенсивно­ стью 60 мВт/см2 (1 МГц) заметно снижает митотический индекс в тканях печени крыс. Облучение ультразвуком (2 МГц; 0,1Вт/см2; 5 мин) клеток аденокарциномы Эрлиха приводит к торможению роста опухоли, возникшей при перевивании этих клеток. Патогенность об­ лученных ультразвуком клеток карциномы имеет тенденцию к восста­ новлению и во втором пассаже мало отличается от контрольных об­ разцов. Снижается скорость деления и при воздействии ультразвуком на клетки в культуре фибробластов человека.

Наиболее существенна задержка в скорости деления клеток куль­ туры лейкомичных мышей при действии ультразвука (1 МГц; длитель­ ность импульса - 1 мс; частота следования импульсов 1 кГц; 5 Вт/см2) на «покоящуюся» клетку. Задержка практически незаметна, если клет­ ка находится в стадии митотического деления, хотя ее механическая прочность уменьшается, что, по-видимому, обусловлено значительны­ ми изменениями в структуре клетки, предшествующими ее делению. Так, фибриллярная структура митотического веретена может разру­ шаться при воздействии ультразвуком относительно невысоких интен­ сивностей (0,8 МГц; 0,2...0,5 Вт/см2).

В настоящее время есть очень мало данных, характеризующих чувствительность клеток к ультразвуку в разные фазы митотического цикла. Представляются бесспорными лишь факты задержки клеточ­ ного деления в интерфазе и меньшей чувствительности митотическо­ го индекса к ультразвуку в период митоза.

Задержка клеточного деления под влиянием различных воздейст­ вий относится не к патологическим проявлениям, а к физиологиче­ ским защитным реакциям, направленным на увеличение длительно­ сти интерфазы до значений, достаточных для репарации нарушений, накопившихся в клетке. Повреждения, не отрепарированные в интер­ фазе, могут во время митоза проявиться в виде серьезных дефектов, приводящих клетку к гибели.

стности хромосомных аберраций. Область под осью характеризуется отсутствием влияния ультразвука на частоту хромосомных аберра­ ций. Сравнивая дозы, мы, очевидно, не учитываем возможности того, что эффект может зависеть нелинейно от интенсивности ультразвука или времени облучения. Отчасти этим, а отчасти различиями в экспе­ риментальных условиях и в природе исследуемых объектов может объясняться наложение областей, где одни исследователи обнаружи­ ли эффект хромосомных аберраций, а другие - нет.

Механизм возникновения аберраций в ультразвуковом поле неиз­ вестен.

3.3.5. Комбинированное действие ультразвука и некоторых других физико-химических факторов на клетки

Широкое внедрение в клинику комплексных методов лечения и часто встречающиеся сочетания ультразвука с другими физическими факторами и фармакологическими средствами потребовали специ­ ального изучения реакции организма в целом и клетки в частности на такие комбинированные воздействия.

Особый интерес представляет исследование последовательного и одновременного действия на клетки ионизирующего и ультразвуково­ го излучений. Подобная совокупность воздействий нередко встреча­ ется в диагностике и в терапии и требует пристального внимания в связи с тем, что, по крайней мере, ионизирующие излучения способны вызывать различные хромосомные аберрации.

Так, при сравнении действия рентгеновского излучения (290 Р) и ультразвука (1 МГц; 1,1 Вт/см2; 1 мин; непрерывный режим) на клет­ ки меристемы корешков гороха было показано, что число микроядер в клетках увеличивается только в первом случае и никогда - во втором. Это лишний раз подтверждает мутагенную активность рентгеновско­ го излучения и отсутствие этого свойства у ультразвука указанных па­ раметров.

Не увеличивается число хромосомных аберраций, индуцирован­ ных в клетках костного мозга мышей рентгеновским облучением (50 Р) после предварительной ультразвуковой (0,8 МГц; 0,1...1 Вт/см2; 5 мин) обработки.

Несколько иная картина наблюдалась при исследовании реакции лимфоцитов на комбинированное ультразвуковое и рентгеновское (20, 50,100 Р) воздействие. Ультразвук (0,8 МГц; 3 Вт/см2; 10 мин) сущест­ венно увеличивает число хромосомных нарушений, если цельная кровь, в которой находились лимфоциты, сначала подвергалась радио­ активному, а затем (через 5 мин) ультразвуковому воздействию. Если кровь сначала подвергалась действию ультразвука, а затем ионизирую­ щего излучения, число хромосомных аберраций не увеличивалось. Ес­ ли на клетки после рентгеновского облучения в течение часа действо­

вать ультразвуком низкой интенсивности (2 МГц; 0,02 Вт/см2), число хромосомных нарушений заметно уменьшается по сравнению с кон­ трольными образцами. Тот же ультразвук, использованный до рентге­ новского облучения, заметно увеличивает (по сравнению с контроль­ ным образцом) число нарушений в клеточных хромосомах.

Сообщается о высокой чувствительности к комбинированному воздействию и других клеточных характеристик. Обнаружен синер­ гизм в действии ультразвука (1 МГц; 10 Вт/см2 5РТР \ 5 мин) и иони­ зирующих излучений (600...1000 рад) на электрофоретическую под­ вижность раковых клеток. Ультразвук (0,9 МГц...0,14 Вт/см2; 10 мин) в 1,3 раза снижает дозу последующего облучения рентгеновскими лу­ чами, необходимую для уничтожения 99 % клеток в культуре, способ­ ных образовывать колонии. Один лишь ультразвук не влияет на этот параметр. Пострадиационное облучение ультразвуком не меняет реак­ ции клеток на рентгеновские лучи.

Зависимость реакции клетки на ультразвуковое воздействие от ее состояния наглядно проявляется в опытах с клетками, метаболизм ко­ торых целенаправленно изменен различными веществами или подбо­ ром внешних условий. Так, выживаемость клеток Не Ьа повышается на 22 %, если их облучать ультразвуком (0,9 МГц; 0,2 Вт/см2; 3 с) в среде, содержащей 30...35 % версена. Защитными свойствами обладает и сывороточный компонент питательной среды, обеспечивающий нормальную работу защитных механизмов клетки. Он повышает на 80 % выживаемость клеток Не Ьа и предотвращает подавление роста культуры, облученной ультразвуком.

Комбинированное действие ультразвука с различными вещества­ ми удобно исследовать на клетках дрожжей.

Дрожжи - типичные сапрофиты, нашедшие широкое применение в пищевой промышленности и кормопроизводстве. Для своей жизне­ деятельности они нуждаются лишь в кислороде, сахарах определенно­ го типа и неорганических солях. Сахар служит источником энергии и основным исходным продуктом для синтеза белков, жиров, витами­ нов и других жизненно важных органических веществ. Благодаря тол­ стой клеточной стенке дрожжи весьма резистентны к ультразвуково­ му воздействию и остаются жизнеспособными при достаточно интен­ сивном и длительном ультразвуковом облучении. Именно поэтому они являются удобной моделью для изучения действия ультразвука на проницаемость клеточных мембран, а также на некоторые процес­ сы жизнедеятельности.

Реакция клеток дрожжей на ультразвуковое воздействие отража­ ется на их фотоиндуцированной хемилюминесценции, связанной с активностью обменных процессов (рис. 3.12). При облучении ульт­ развуком с интенсивностью 0,4 Вт/см2 практически все клетки в сус-

1(Н моль приводит к необратимому уменьшению интенсивности свечения. При концентрации 10_3 моль это вещество обратимо уменьшает интенсивность свечения, восстановление которой происходит в течение 30...40 мин. Восстановление интенсивно­ сти свечения до исходного уровня, очевидно, обусловлено функциони­ рованием защитных механизмов клетки, соответствующим образом пе­ рестраивающих ее метаболизм. Ультразвук низких интенсивностей (0,1...0,2 Вт/см2) стимулирует этот процесс в 1,5-2 раза, сокращая время

Аналогичные результаты получены при изучении совместного дейст­ вия ультразвука с динитрофенолом и ЫазИ. Чувствительность клеток дрожжей в суспензии к ультразвуку существенно зависит от их состоя­ ния. Так, интенсивность свечения суспензии, содержащей 1 % глюкозы, понижалась в 4-6 раз при комбинированном действии Ыаг5 (10_3моль) и ультразвука (1 МГц; 1 Вт/см2; 10 мин). Эффект не наблюдался, если клетки находились в среде, не содержащей глюкозу.

Скорость связывания лимфоцитами 45Са++ вдвое повышается под действием ультразвука интенсивностью 0,05 Вт/см2 и продолжитель­ ностью 30 с. Накопление Са++ в лимфоцитах влияет на характер им­ мунного ответа лимфоцитов и, кроме того, является необходимым ус­ ловием их активации. В частности, растительный митоген конканавалин также существенно ускоряет процесс накопления ионов Са++ в лимфоцитах. Действие конканавалина связывают с изменениями в структуре плазматических мембран, с интенсификацией обмена мем­ бранных белков и жирных кислот в фосфолипидах, а также с образо­ ванием кальциевых каналов, пронизывающих мембрану.

Результат комбинированного действия конканавалина и ультразву­ ка (0,88 МГц; 0,05 Вт/см2; 60 с) на лимфоциты вчетверо превосходит влияние одного только митогена (30 мкг/ мл) или только ультразвука.

Повышение проницаемости клеточных мембран для ряда ве­ ществ, очевидно, и объясняет увеличение эффективности лекарствен­ ных веществ под действием ультразвука.

Например, ультразвук (880 кГц; 0,4 Вт/см2) существенно увели­ чивает эффективность влияния на рост и интенсивность биолюминес­ ценции светящихся бактерий цитотоксических лекарственных препа­ ратов: цитостатина, циклофосфана и антибиотика широкого спектра действия дексорубицина, используемых для лечения злокачествен­ ных новообразований.

Кокаин и кураре в низких концентрациях проявляют защитные свойства при повреждающем действии ультразвука на ткани голова­ стиков. Вещества, защищающие клетки от повреждающего ультразву­ кового воздействия, можно назвать сонопротекторами по аналогии с радиопротекторами, защищающими биологические объекты от иони­ зирующих излучений.

3.3.6. Разрушение клеток под действием ультразвука

При ультразвуковой кавитации суспендированные в жидкости клетки испытывают значительные механические усилия и разруша­ ются (см. §§ 1.13, 2.14). Особенно эффективен для разрушения клеток низкочастотный ультразвук. Например, вблизи колеблющегося с час­ тотой 20 кГц торца ультразвукового инструмента гемолиз наблюдает­ ся при амплитудах 16...20 мкм (рис. 3.14).

Для молекул, диффундирующих сквозь нее, этот коэффициент определяется толщиной мембраны и коэффициентом диффузии.

В реальных условиях слои раствора, непосредственно прилегаю­ щие к мембране, практически не перемешиваются, следовательно, кон­ центрация диффундирующих молекул в данных слоях может сущест­ венно отличаться от концентрации аналогичных молекул в объеме. Толщина этих так называемых слоев Нернста меняется от единиц до сотен микрометров и зависит от свойств поверхности и интенсивности перемешивания раствора. Совокупность собственно мембраны с диф­ фузионными слоями можно рассматривать как эффективную мембра­ ну, толщину которой определяют по формуле:

где Лдг1 и Длг2 - толщины диффузионных слоев по обе стороны от мембраны.

Поток через мембрану описывается уравнением

Здесь Д>фф - обобщенный коэффициент диффузии с прилегающими слоями;

Рэфф - проницаемость; си С2 - концентрации молекул.

Под влиянием ультразвука величины Алл и А*2 существенно уменьшаются в результате интенсивного перемешивания раствора микропотоками. Соответственно уменьшается /эфф и возрастает поток веществ через мембрану.

Коэффициент диффузии в среде и диффузионных слоях также может меняться под действием ультразвука, так как цитоплазма и прилегающая к поверхности клетки среда отличаются выраженной тиксотропией, и уже при интенсивности ультразвука 40 мВт/см2, ис­ пользуемой в диагностике, вязкость клеточного содержимого сущест­ венно уменьшается, а температура среды несколько увеличивается за счет поглощения ультразвуковой энергии (см. § 1.3). Возрастание тем­ пературы среды и уменьшение ее вязкости приведут к увеличению ко­ эффициента диффузии в примембранных слоях, что обусловит увели­ чение потока молекул неэлектролитов через мембраны. Это может проиллюстрировать эффект ускорения транспорта сахаров через мем­ браны эритроцитов под действием ультразвука с интенсивностью 0,1 Вт/см2 (см. § 3.2).

Путем обычной диффузии через клеточные мембраны в клетку проникают самые разные соединения. Помимо воды это незаряжен­ ные молекулы многих растворимых в воде веществ, в том числе мно­