книги / Основы взаимодействия ультразвука с биологическими объектами

По данным разных авторов, акустико-энергетический (хими­ ко-акустический) выход водородпероксида имеет значение порядка 1020молекул/кДж, т. е. на 1 кДж поглощенной звуковой энергии обра­ зуется примерно Н И моль Н 2О2.

Для оценки интенсивности ультразвука могут быть использованы и другие простые реакции.

Так, скорость образования азотистой НЫОг и азотной НЫОз ки­ слот в воде, насыщенной воздухом, прямо пропорциональна интен­ сивности ультразвука в диапазоне от 0,6 до 4 Вт/см2. Более сложные реакции, например реакции с биополимерами, непригодны для этой цели, так как зависимости скоростей ультразвуковых химических ре­ акций с участием макромолекул от интенсивности ультразвука имеют сложный характер.

Образование азотистой НЫОг и азотной НЫОз кислот в присутст­ вии растворенного азота весьма существенно при ультразвуковом воз­ действии на биологические объекты. Эти кислоты и их ангидриды мо­ гут активно реагировать с биоорганическими молекулами и оказывать сильное повреждающее действие.

Одним из вероятных механизмов образования кислородсодержа­ щих соединений азота является взаимодействие молекулярного азота N2с продуктами сонолиза воды.

Экспериментально показано, например, что при температурах по­ рядка 600 К в автоклаве (без ультразвука) идет реакция связывания молекулярного азота:

N2 + 4Н 20 2-» Н Ш 2+ Ш О 3+ЗН2О

Предположение, выдвигаемое в некоторых работах, о распаде мо­ лекулярного азота N2на атомы:

N2-* №- N

не имеет достаточных экспериментальных доказательств.

Возникшие при сонолизе свободные водородные Н и гидроксиль­ ные ОН радикалы в присутствии кислорода инициируют окисление биоорганических соединений в организме, подвергаемом ультразвуко­ вым воздействиям.

Окисление органических соединений в жидкой фазе хорошо изучено. Этот процесс является сложной радикально-цепной реак­ цией с вырожденным разветвлением. При действии ультразвука процесс описывается следующей принципиальной схемой (здесь КН - соединение с органическим радикалом К. и подвижным ато­ мом водорода Н):

Зарождение цепи, или образование радикалов (\У| - скорость об­ разования радикалов Н и ОН под действием ультразвука на водные растворы):

КН + ОН-» К + Н20

Продолжение цепи:

Совокупность реакций (1-6) представляет общую схему окисления органических веществ.

В зависимости от природы биоорганических соединений КН и усло­ вий окисления (скорость ЧУ, и концентрации КН, О2, КООН) механизм и скорость процесса могут значительно различаться. Особенно легко окисляются липиды клеточных мембран. Поэтому рассмотренный меха­ низм широко известен как пероксидное окисление липидов (ПОЛ). Со­ ответственно под КН и КООН следует понимать липид и его пероксид.

По механизму взаимодействия с радикалами биоорганические со­ единения КН можно разбить на три основных класса.

К первому классу относят соединения ^ Н , взаимодействующие с пероксидными радикалами КО2:

К этим соединениям относятся фенилаланин, триптофан, токофе­ ролы. Скорость реакции этих веществ с КО2 зависит от константы скорости кп реакции (7) и стехиометрического коэффициента/ - чис­

ла цепей, которые обрывает одна молекула ингибитора. Очень часто / = 2. Механизм реакции (7) зависит также от радикала Кь Если этот радикал достаточно активен и до того, как прореагирут с КОг (или с К.) вступит в реакцию с КН или КООН с образованием активных К или К Ог, то это ослабит его взаимодействие с КОг:

К , + К О О Н -> К ,Н + К 0 2 (реакция, обратная 7)

ч-К Н -^Н +К

Квторому классу относят соединения К1Н, взаимодействующие с гидропероксидом КООН с образованием свободных радикалов:

К ^Н +К О О Н -» К 1Н+К.О+Н 2О

Обычно эта реакция протекает медленно, но в некоторых случаях ее необходимо учитывать.

Реакция соединения К1Н с кислородом

К.}Н+02—>К.) +но2

протекает очень медленно из-за высокой эндотермичности (105... 150 кДж/моль) и низкой концентрации растворенного в окис­ ляющемся веществе кислорода.

К третьему классу относят соединения, обрывающие цепи в ре­ зультате взаимодействия с алкильными радикалами. К таким соедине­ ниям относятся хиноны, йод. Например:

Ь + К-» 1+К1

1+К -» К1

Соединения, разрушающие гидропероксиды без образования сво­ бодных радикалов, например, метионин, дисульфиды пептидов, тор­ мозят пероксидное окисление:

КООН + К5К -> КОН + К25 0

КООН + К25 0 -» КОН + К25 0 2

Смесь таких веществ-антиоксидантов в клетке может привести к сильному тормозящему действию. При этом тормозящий эффект сме­ си может превосходить сумму эффектов тормозящего действия каж­ дого из компонентов. Данное явление называется синергизмом.

Характер влияния ультразвука на химические реакции зависит от многих факторов: от частоты и интенсивности акустических колеба­

ний, от температуры и давления, от природы и концентрации раство­ ренных газов.

Некоторые реакции лишь ускоряются в ультразвуковом поле, другие же без воздействия ультразвука вообще не происходят.

Реакции, протекающие лишь при ультразвуковом инициировании в гомофазных растворах, представляют особый интерес и могут быть условно разделены на несколько классов.

1. Реакции между газами, парами воды и веществами с высокой упругостью пара в газовой фазе внутри кавитационной полости.

При схлопывании внутри кавитационного пузырька и в малой ок­ рестности вокруг него температура и давление значительно выше кри­ тических для растворителя. Следовательно, локально достигаются сверхкритические состояния. В таких условиях молекулы как раство­ рителя, так и растворенных веществ, подвергаются термическому рас­ паду с образованием атомов и радикалов. Наиболее детально изучен распад воды с образованием радикалов Н и ОН. Установлено эффек­ тивное разложение четыреххлористого углерода при ультразвуковой обработке.

Менее 10% радикалов Н и ОН, образующихся в кавитационном пузырьке из-за процессов рекомбинации, достигают жидкой фазы. При взаимодействии радикалов (при отсутствии молекул-захватчи- ков или частиц твердой фазы) образуется Н2О2. Образующийся при рекомбинации радикалов ОН водород пероксид ответственен за боль­ шинство реакций окисления, изучавшихся в водных растворах при ультразвуковой обработке. Сюда можно отнести, например, реакции окисления: Ре(П) - » Ре(Ш), Г - » I .

Многие авторы отмечают, что заметному разложению при ультра­ звуковой обработке подвергаются вещества, летучесть которых не­ сколько выше или сравнима с летучестью растворителя при данной температуре. Тогда внутри кавитационного пузырька давление пара растворенного вещества будет больше или сравнимо с давлением пара растворителя.

Если летучесть вещества значительно меньше летучести раство­ рителя, то воздействие ультразвука может осуществляться только че­ рез другие механизмы.

2.Окислительно-восстановительные реакции, которые идут в жидкой фазе между растворенными веществами и образующимися в пузырьках продуктами ультразвукового расщепления молекул воды, газов и проникающих в кавитационную полость веществ с высокой упругостью паров.

3.Цепные реакции в растворе, инициируемые не радикальными продуктами Н и ОН распада молекул Н2О, а каким-либо другим ве­ ществом, присутствующим в растворе и расщепляющимся в кавита­ ционной полости.

4.Ультразвуковые химические реакции с участием синтетических

ибиологических полимеров.

Энергетический выход продуктов химических реакций, иниции­ руемых ультразвуком, как правило, невелик. Поэтому на практике эти реакции используют лишь в исключительных случаях: либо когда нет другого способа получения продуктов, либо когда с ценой результата не приходится считаться.

Например, ультразвук нашел применение для инициирования по­ лимеризации используемых в медицине и ветеринарии акрилатных клеев при ультразвуковой «сварке» костей и мягких тканей.

Следует отметить, что при ультразвуковом воздействии интен­ сификация диффузионных процессов в результате перемешивания жидкости (акустические потоки) может привести к ускорению хи­ мических процессов, протекающих в обрабатываемых растворах, однако этот эффект не связан с прямым химическим действием ультразвука.

Механохимические ультразвуковые эффекты и продукты реак­ ций в кавитационных полостях в определенных условиях могут обу­ словить существенные изменения в биологических средах и должны учитываться при обсуждении механизма биологического действия ультразвука.

Ультразвуковая эрозия - это стойкие механические изменения на поверхности тел, граничащих с кавитирующей жидкостью, явля­ ется результатом наложения химических, электрических и механи­ ческих факторов, причем последним, очевидно, принадлежит ос­ новная роль.

1.10. УЛЬТРАЗВУКОВОЕ СВЕЧЕНИЕ

Ультразвуковое свечение - это слабое свечение воды и некоторых других жидкостей, помещенных в ультразвуковое поле. В разное вре­ мя было выдвинуто более десяти гипотез, в той или иной мере объяс­ нявших экспериментальные данные.

Первая группа гипотез основана на предположении о нагревании содержимого захлопывающегося пузырька до высоких температур. Другая группа гипотез - на представлении о возможности разделения зарядов на стенках пульсирующей полости, что приводит к электриче­ скому пробою, который, как и высокие температуры, может иниции­ ровать свечение и химические реакции.

Наряду с ионами и радикалами, долго существующими в среде, где нет веществ, способных с ними реагировать, в кавитационной по­ лости образуются возбужденные молекулы, в том числе НгО*. кото­ рые уже спустя 10-9...10-8 с спонтанно возвращаются в исходное со­

стояние, либо выделяя избыточную энергию в виде кванта электро­ магнитного излучения, либо рассеивают ее в виде теплоты.

В воде, насыщенной воздухом, под действием ультразвука с часто­ той 880 кГц кавитация начинается при средней интенсивности (5АТА) 0,12 Вт/см2 (максимальная интенсивность 0,3...0,5 Вт/см2). При боко­ вом освещении в воде, облучаемой ультразвуком, можно видеть обла­ ко пузырьков разных размеров, часть которых уносится из кавитаци­ онной зоны акустическими потоками. Практически одновременно с образованием пузырьков возникает ультразвуковое свечение, начина­ ются химические реакции и регистрируется шум в широком диапазо­ не частот, а также ярко выраженная субгармоническая составляющая на частоте 440 кГц.

Увеличение частоты ультразвука приводит к повышению порога кавитации.

Зависимости интенсивности ультразвукового свечения, скорости химических реакций и электропроводности воды от интенсивности ультразвука имеют одинаковый характер, что доказывает их связь с кавитацией и отражает природу процессов, протекающих в пузырь­ ках. Зависимость ультразвукового свечения от свойств растворенных в жидкости веществ позволяет использовать его в диагностических целях, например, в тех случаях, когда патологические процессы связа­ ны с выбросом в плазму крови соединений, влияющих на ее свечение, возникающее при кавитации.

1.11.ВЛИЯНИЕ УЛЬТРАЗВУКА НА ВОДУ

ИВОДНЫЕ РАСТВОРЫ

Если кубик льда подвергнуть действию ультразвука, лед внутри мутнеет и останется мутным, как бы запомнив результат ультразвуко­ вого воздействия.

Жидкая вода «помнит» любое, в том числе и ультразвуковое, воз­ действие лишь короткое время 10_9...10~12 с. Поэтому неправомерно объяснять ультразвуковые эффекты «структурной памятью» воды.

Нетрудно подсчитать, что в этом случае ближайшие молекулы во­ ды соседствуют на поверхности пульсирующего пузырька в течение примерно 10~9 с. Следовательно, при кавитации поверхность пузырь­ ка не успеет сформироваться, и в этом случае поверхностное натяже­ ние будет отличаться от поверхностного натяжения покоящейся воды.

Очевидно, что если в разных участках поверхности пузырька на­ тяжение окажется различным, то пульсирующий пузырек потеряет сферическую форму и станет источником энергичных микропотоков, способных обусловить ряд биоэффектов.

1.12.УЛЬТРАЗВУКОВАЯ КАВИТАЦИЯ

ВБИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ

Вмедицинской и ветеринарной практике, в биотехнологии и экс­ периментальной биологии используется воздействие ультразвуком

самых разных параметров на среды с неодинаковыми физико-химиче­ скими свойствами. В каждом случае вопрос о возможности возникно­ вения кавитации должен рассматриваться отдельно, так как пороги кавитации и ее активность зависят от параметров ультразвука и свойств среды.

1.12.1. Кавитация в суспензии клеток

При повышении интенсивности ультразвука до значений, когда в среде возникают механические усилия, сравнимые с прочностью кле­ точных мембран, начинается процесс разрушения клеток. Обычно по­ явление значительных механических возмущений в жидкостях связа­ но с возникновением в них стабильных и нестабильных газовых пу­ зырьков, которые могут образоваться в воде и водных средах, если интенсивность ультразвука превышает порог кавитации.

Так, клетки одноклеточной водоросли 5сап<1е$ти$ СиаДпсапйа на­ чинают разрушаться при усредненной по пространству интенсивности, равной 0,2...0,3 Вт/см2, при частоте 1 МГц, что соответствует порогу ка­ витации в водных суспензиях с небольшой концентрацией клеток. Ско­ рость разрушения клеток увеличивается с увеличением интенсивности ультразвука. Число разрушенных в единицу времени клеток пропор­ ционально числу кавитационных событий.

Свечение фотобактерий в суспензии или синтез интерферона лей­ коцитами резко подавляется при возникновении ультразвуковой ка­ витации. Подавление кавитации каким-либо способом обычно защи­ щает клетки от разрушения и даже от более тонких изменений.

Скорость разрушения амебы АсШпатоеЬа сазСеИапп уменьшается, если облучать импульсным ультразвуком клетки, суспендированные в растворе желатина, порог кавитации в котором из-за его большой вяз­ кости значительно выше, чем в воде.

Этим же объясняется снижение скорости ультразвукового разру­ шения эритроцитов при увеличении их концентрации, вплоть до поч­ ти полной остановки гемолиза, если суммарный объем частиц в сус­ пензии достигает 2 %, что соответствует высоким значением эффек­ тивной вязкости среды.

Самого факта появления пульсирующих газовых пузырьков в среде еще недостаточно для разрушения клеток. Эффект наблюдается, если амплитуда пульсаций пузырьков возрастает до определенной ве­ личины. Величина эта различна для разных клеток, зависит от их фор­

предметом многолетней дискуссии. Сложность идентификации кави­ тации в ткани обусловлена ее относительной непрозрачностью, пре­ пятствующей непосредственному наблюдению и затрудняющей при­ менение оптических методов.

Ф акт протекания кавитационных процессов в данной среде мо­ жет быть надежно установлен при одновременном появлении, по крайней мере, трех эффектов, сопровождающих кавитацию: харак­ терного шума, ультразвуковых химических реакций или свечения, микропотоков.

Косвенным подтверждением возможного возникновения кавита­ ции в тканях могут служить «дыры», обнаруженные на гистологиче­ ских препаратах тканей печени и других органов, облученных ультра­ звуком с частотой 1 МГц и интенсивностью 0.05...2 Вт/см2.

Пороги кавитации для фокусированного ультразвука в тканях не более чем в 1,5-2 раза выше, чем в отстоявшейся водопроводной воде. Если это соотношение сохраняется и для плоской бегущей волны, то кавитацию в тканях можно ожидать при интенсивности, превышаю­ щей 0,6 Вт/см2, так как теоретический порог кавитации в во­ де около 0,3 Вт/см2.

Основными признаками акустической кавитации в воде и вод­ ных средах, насыщенных воздухом, помимо характерного шума можно считать ультразвуковое свечение и синтез Н2О 2, НгИОг, НгИОз, а также свободных радикалов и других химически актив­ ных частиц. Эти явления наблюдаются в воде и разбавленных вод­ ных растворах при интенсивности 0,3 Вт/см2 (&4), а в плазме крови при 0,8 В т/см 2.

Очевидно, что под действием ультразвука химически активные частицы могут образоваться непосредственно в клетке. Это мало отра­ зится на картине ультразвукового повреждения, но может привести к самым неожиданным последствиям - нарушению обменных процес­ сов в клетке, изменению ее наследственного аппарата и т. п.

Пожалуй, только при ультразвуковом воздействии источник све­ чения - кавитирующий пузырек - может находиться вблизи или внутри самой клетки. Влияние этого излучения, особенно его ультра­ фиолетовой составляющей, может обусловить, в зависимости от ин­ тенсивности и условий облучения, стимуляцию и повышение жизне­ способности клеток, находящихся в угнетенном физиологическом состоянии, торможение деления клеток и их отдаленную гибель, уве­ личение проницаемости клеточных мембран, конформационные из­ менения в молекуле ДНК, инактивацию некоторых ферментов и другие эффекты.

Измерение интенсивности ультразвукового свечения в оптически плотных животных тканях затруднительно, а идентификация образую­ щихся в ультразвуковом поле частиц химическими или биохимическими

методами практически невозможна, что обусловлено их малой концен­ трацией и высокой химической активностью.

Использование в качестве модели относительно прозрачной ткани клубня картофеля позволяет измерить в ней интенсивность ультразву­ кового свечения и определить пороги кавитации, сопровождающейся об­ разованием химически активных частиц и, очевидно, другими, свойст­ венными кавитации, эффектами.

Для определения порога кавитации клубень картофеля нареза­ ют на пластинки толщиной 0,05...0,25 см. Пластинки «притирают» к поверхности излучателя ультразвука, слегка смоченного водой для обеспечения акустического контакта. Свечение ткани регистриру­ ют с помощью фотоумножителя (рис. 1.6). Химически активные частицы в тканях при ультразвуковой кавитации определяют по свечению пластинок, предварительно вымоченных в течение не­ скольких часов в растворе люминола. Реакция люминола с перок­ сидом водорода или ОН-радикалами, как известно, сопровождается характерным голубовато-зеленым свечением.

При облучении ткани клубня картофеля непрерывным ультразву­ ком с частотой 880 кГц свечение возникает при интенсивностях 0,3...0,4 Вт/см2 (5А) и усиливается с увеличением интенсивности ультразвука.

Характер зависимости свечения ткани картофеля от интенсивно­ сти ультразвука сходен с аналогичной зависимостью для воды и вод­ ных растворов. Очевидно, что в обоих случаях ультразвуковое свече­ ние обусловлено кавитацией.

Дополнительным свидетельством этому служит шум в ткани картофеля, регистрируемый с помощью гидрофона на частоте первой субгармоники (табл. 1.4), а также интенсивное свечение, возникающее