книги / Основы взаимодействия ультразвука с биологическими объектами

При этой частоте порог кавитации в суспензии клеток около 0,35 Вт/см2, а резонансный радиус кавитационного пузырька примерно 3 мкм, что со­ измеримо с усредненным радиусом форменных элементов крови. Кави­ тационных пузырьков при этих условиях намного меньше, чем клеток в суспензии, и кавитация не вносит значительных возмущений в светорас­ сеяние.

В устойчивом режиме кавитации обусловленное ею светорассея­ ние не меняется во времени, и поправка сводится к сдвигу всех мгно­ венных значений ординат экспериментальной кривой на величину, обусловленную кавитационным светорассеянием (рис. 2.13, б).

Нормированная ультразвуковая цитолизограмма в интегральной форме соответствует распределению изучаемых клеток по механиче­ ской резистентности.

Интегральную ультразвуковую цитолизограмму дифференцируют и анализируют на наличие локальных экстремумов. Если таких экстрему­ мов нет, то цитолизограмму можно представить в аналитическом виде:

где 17* - показания регистратора в момент измерения; Цм - показания регистратора в конце измерений, когда светорас­

сеяние перестает изменяться, характеризуя окончание процесса. Параметры Ьо и Т находят методом наименьших квадратов, спрям­

ляя экспериментальную кривую в полулогарифмических координатах:

Если предэкспоненциальный множитель Ьо = 1 (в пределах ошиб­ ки измерения), то ультразвуковая цитолизограмма имеет вид простой экспоненты, описывается приведенным выражением и может быть полностью охарактеризована постоянной времени Т.

Если же величина Ьо * 1, то цитолизограмма имеет более сложный характер и определяется выражением:

I/, ={/„ 1 -А 0е т° - А хе т'... - А пе Тп

при условии, что сумма коэффициентов Ао + А\ + ... Ап= 1. Ультразвуковые цитолизограммы в основном можно условно раз­

делить на четыре типа.

1.Если цитолизограмма имеет вид экспоненты, то, учитывая чис­ то вероятностный характер процесса ультразвукового лизиса, можно полагать, что все клетки исследуемого образца равнозначны по меха­ нической резистентности, которая пропорциональна постоянной вре­ мени ( Г) экспоненты.

2.Если цитолизограмма апроксимируется суммой экспонент, то, вероятно, исследуемая популяция клеток неоднородна по механиче­ ской резистентности и представляет собой совокупность нескольких групп, внутри которых клетки равнозначны. В этом случае каждый из предэкспоненциальных множителей Аь равен относительной концен­ трации клеток в данной группе. Механическая резистентность клеток

вкаждой группе может быть охарактеризована постоянной времени для этой группы - 7*.

Время, за которое происходит полный лизис (Г<»), характеризует усредненную механическую резистентность клеток в обоих вышепри­ веденных случаях. В первом случае информативность параметров Г» и Г равнозначна, во втором необходимо учитывать, что на парамет­ ре Г не отражается неоднородность исследуемой популяции клеток.

При сравнительном анализе удобно пользоваться тремя парамет­ рами - Г, Г» и Ьа. Степень отклонения Ьо от единицы характеризует неоднородность исследуемой популяции клеток, а увеличение Г или Г» свидетельствует о возрастании усредненной механической рези­ стентности клеточных мембран.

3.Явно не экспоненциальный характер цитолизограммы, как пра­ вило, связан со спонтанным лизисом клеток, либо с методическими ошибками (например, с неправильным определением начала процесса).

4.Неполный при данных условиях ультразвуковой лизис свиде­ тельствует либо о присутствии в образце группы клеток с аномально высокой механической резистентностью, либо о незавершенности

процесса лизиса.

Анализ результатов ультразвукового цитолизиса удобно прово­ дить с использованием компьютера.

При подборе оптимальных значений: начальной концентрации клеток в суспензии, ее температуры, средней плотности энергии в ультразвуковом поле и пр. - можно подобрать условия, варьирование которых в определенных пределах мало влияет на воспроизводи­ мость, точность и информативность конечного результата.

Для определения оптимальных условий ультразвукового цитоли­ зиса была исследована динамика ультразвукового разрушения тромбо­ цитов, эритроцитов, лейкоцитов ряда животных при изменении на­ чальных концентраций клеток (турбодиметрическое ослабление в пре­ делах 0,1-1,2) и при плотности энергии ультразвука 0,04...0,13 Вт/см3.

Исследование проводили при температуре 24 °С, так как в интер­ вале 22...28 *С характер ультразвуковых цитолизограмм практически

не зависит от температуры. Было установлено, что при 100 %-ном ультразвуковом лизисе относительное турбидиметрическое ослабле­ ние для эритроцитов принимает значение 14—15, для лейкоци­ тов - 12-14, для кровяных пластинок - 10-12. Порог кавитации при повышении концентрации эритроцитов и лейкоцитов в суспензии до значений, соответствующих турбидиметрическому ослаблению, - 1,2 (для тромбоцитов 0,9) оставался в пределах 0,04...0,05 Вт/см3.

Турбидиметрическое ослабление, обусловленное кавитацией, че­ рез 1...2 с после ее возникновения устанавливается на постоянном уровне, практически не зависит от концентрации клеток в суспензии и составляет 0,01-0,05 (в зависимости от интенсивности ультразвука) при 540...750 нм. Для форменных элементов крови различного проис­ хождения динамика ультразвукового лизиса максимально различает­ ся при плотности энергии 0,04 Вт/см3. При 0,08...0,09 Вт/см3 различия существенно уменьшаются вплоть до полной нивелировки. Однако ошибка воспроизводимости метода в соответствии с оценкой по двум параметрам (время 50 %-ного и 100 %-ного лизиса) при плотности энергии 0,04 Вт/см3 в некоторых случаях достигает 40 %. При увели­ чении плотности энергии до 0,05...0,06 Вт/см3 ошибка воспроизводи­ мости снижается до 5 %.

Для каждого типа клеток при всех исследованных плотностях энергии в поле ультразвука существует область достаточно малых концентраций клеток, в которой динамика ультразвукового цитолизи­ са практически не зависит от концентрации (табл. 2.1).

Таблица 2.1

Концентрация клеток (по турбидиметрическому ослаблению),

при которой динамика ультразвукового цитолиэиса не зависит от плотности ультразвуковой энергии

Во всех случаях для ультразвуковой цитолизометрии оптимальной является средняя плотность ультразвуковой энергии, равная 0,05 Вт/см3, которую можно обеспечить, излучая в кювету объемом 8 см3 звук с ин­ тенсивностью 0,4 Вт/см2. Оптимальная концентрация клеток в иссле­ дуемой суспензии соответствует величине начального турбидиметрического ослабления 0,2-0,35. При более высокой концентрации клеток ус­ ложняется интерпретация экспериментальных кривых, так как

уменьшением размера и массы животного (табл. 2.2). Соответственно уменьшается и длина пути, проходимого эритроцитами за время одно­ го оборота. Средние числа оборотов за время существования эритро­ цитов и время одного полного оборота были рассчитаны, исходя из данных о полном объеме крови, минутном объеме сердца и времени жизни эритроцитов соответствующих животных.

Таблица 2.2

Масса тела и некоторые параметры кровообращения теплокровных

Поскольку число оборотов эритроцитов за время их существова­ ния у всех видов животных примерно одинаково, то у мелких живот­ ных эритроциты за время их существования проходят значительно меньший путь, чем у животных крупных размеров.

По-видимому, это одна из причин, обусловливающих необходи­ мость в более высокой механической прочности мембран эритроцитов крупных животных, так как в кровяном русле, в особенности в узких капиллярах, эритроциты подвергаются значительным механическим воздействиям. Прямая пропорциональность между ультразвуковой резистентностью эритроцитов и средним временем их полного обра­ щения свидетельствует в пользу данного предположения. Возможно, прочность мембраны зависит от содержания в ней холестерина и сфингомиелина, увеличивающегося с увеличением массы животного

при соответствующем уменьшении количества фосфатидилэтаноламина и фосфатидилхолина в мембранах.

Сравнивая зависимость, отображенную на рис. 2.14, с известной кривой «от мыши до слона», иллюстрирующей связь интенсивности обмена веществ с массой тела животного, можно предположить, что резистентность эритроцитов также связана с интенсивностью обмен­ ных процессов в организме.

Подтверждение этому было получено при сравнении скорости ультразвукового гемолиза эритроцитов животных одного вида, но на­ ходящихся в разных условиях. Так, эритроциты стриженой овцы ме­ нее устойчивы к ультразвуковому воздействию, чем эритроциты овцы, покрытой шерстью. У коз, обитающих в горах, стойкость эритроцитов выше, чем у коз, живущих в равнинной местности.

Сравнение прочности эритроцитов овцы и барана, быка и коро­ вы, мужчины и женщины показало, что у особей женского пола ультразвуковая резистентность эритроцитов в 1,2 раза ниже, чем у особей мужского пола (рис. 2.15). Интересно отметить, что проч­ ность эритроцитов барана после кастрации постепенно уменьшает­ ся и через 80 дней лишь незначительно превосходит прочность эритроцитов овец.

Характерные изменения в ультразвуковых эритрограммах че­ ловека и животных можно наблюдать при различных физиологиче­ ских состояниях и патологиях. При циррозе печени циркулирую­ щие в крови эритроциты частично повреждаются токсическими продуктами, которые насыщают кровь вследствие функциональной несостоятельности печени. На эритрограмме коров с циррозом пе­ чени наблюдается снижение стойкости всей массы клеток. Такая картина наиболее характерна при циррозе с выраженной недоста­ точностью клеток паренхимы.

Аналогичные по характеру изме­ нения наблюдаются при фасциолезе - паразитарном заболевании печени домашних и диких живот­ ных. Выделяемые паразитом про­ дукты жизнедеятельности оказы­ вают влияние на ткани печени, вызывающие гепатиты и циррозы.

При лейкозах обнаружено по­ вышение ультразвуковой рези­ стентности лейкоцитов и эритроци­ тов, что объясняется пополнением крови формами клеток, обладаю­ щих повышенной прочностью кле­ точных мембран.

При заболеваниях воспалительного характера, таких, как пневмо­ нии, эндометриты, маститы, обнаружено увеличение содержания в кро­ ви клеток с пониженной ультразвуковой резистентностью.

Характерные изменения на эритрограммах животных наблюдают­ ся и при диспепсиях, кетозах и других заболеваниях. Изменяются эритрограммы в зависимости от условий содержания и кормления животных, в том числе домашней птицы.

Ультразвуковая резистентность эритроцитов 15-дневных эм­ брионов кур коррелирует с инкубационным качеством яйца, при­ чем повышение выводимости благодаря доинкубационной обработ­ ке яиц стимуляторами - парааминобензойной кислотой, хлорно­ кислым аммонием или ультразвуком низких интенсивностей соответственно изменяет и ультразвуковую резистентность эритро­ цитов эмбрионов.

В условиях загрязнения окружающей среды промышленными от­ ходами представляет интерес возможность оценки состояния рыб при ртутном отравлении по скорости разрушения их эритроцитов в ульт­ развуковом поле. Предварительно было показано, что некоторые от­ личия в строении эритроцитов рыб не являются препятствием для ис­ пользования метода ультразвукового гемолиза.

Исследования показали, что скорость гемолиза эритроцитов рыбы, обитающей в среде, содержащей препараты ртути, со време­ нем увеличивается, причем скорость ультразвукового гемолиза прямо пропорциональна концентрации ртути, накапливающейся в печени рыбы.

Разработанный вначале для ветеринарных целей метод ультразву­ кового цитолизиса оказался весьма полезным и в медицинской прак­ тике. Так, в результате исследования крови клинически здоровых лю­ дей обоего пола в возрасте 15-60 лет было установлено, что парамет­ ры, характеризующие ультразвуковую резистентность эритроцитов в норме, стабильны. Эта стабильность, очевидно, обусловлена действи­ ем физиологических механизмов, поддерживающих динамическое равновесие в качественном составе красной крови. Ультразвуковая ре­ зистентность эритроцитов в пределах 15-60 лет мало зависит от воз­ раста доноров, тогда как химическая стойкость эритроцитов подвер­ жена существенным возрастным изменениям.

Исследование эритроцитов больных выявило существенные разли­ чия в параметрах, характеризующих ультразвуковой гемолиз в норме и при опухолях. Так, полное время гемолиза эритроцитов здоровых доно­ ров составило (485 ± 10) с, при раке молочной железы - (617 ± 30) с, при раке желудка - (603 ± 40) с, при раке легких - (555 ± 40) с и при лимфогранулематозе - (735 ± 67) с.

При опухолях ультразвуковая резистентность эритроцитов и, сле­ довательно, их механическая стойкость заметно увеличиваются по

сравнению с нормой. Аналогичные данные были получены при лейко­ зах крупного рогатого скота, при спонтанных опухолях у собак, при привитой под колено взрослым крысам карциноме РС-1.

Благоприятно протекающий процесс лечения опухолевого забо­ левания сопровождается снижением прочности мембран эритроцитов, вплоть до значений, характеризующих норму, и чем эффективнее ле­ чение, тем быстрее стремится к норме ультразвуковая резистентность эритроцитов. Очевидно, что быстрое снижение резистентности эрит­ роцитов до нормы можно ожидать также при удачной хирургической операции и незначительные изменения этого параметра при неполном иссечении опухоли или ее метастазов.

Различия в количестве разрушенных эритроцитов наблюдались ранее при ультразвуковой обработке (830 кГц; 0,2...0,8 Вт/см2; 5 мин) разбавленной в 10 раз крови здоровых животных и животных с гипо­ тиреозом и экспериментальным диабетом. Резистентность эритроци­ тов человека к низкочастотному ультразвуковому воздействию (24 кГц, 60 Вт) при некоторых заболеваниях крови также существенно отличается от нормы. Так, при серповидной анемии и сфероцитозе ус­ тойчивость эритроцитов к ультразвуку оказалась заметно повышен­ ной, тогда как дефицит железа в организме приводит к уменьшению стойкости клеток красной крови.

Метод ультразвуковых цитолизограграмм успешно использован и для оценки качества эритроцитов, консервированных при понижен­ ных (+4 °С) и низких (-196 °С) температурах. Ультразвуковая рези­ стентность эритроцитов, хранящихся при +4 °С, скачкообразно уменьшается на 4-й и 17-й день хранения, после чего остается практи­ чески неизменной, вплоть до 22 суток хранения. Этот результат хоро­ шо согласуется с известными данными об увеличении скорости спон­ танного гемолиза в эти сроки. На ультразвуковых эритрограммах, по­ лученных на 4-й и 17-й день хранения, ясно видны различия в распределении эритроцитов по группам стойкости, выражающиеся в увеличении количества менее стойких к ультразвуковому воздейст­ вию клеток.

Консервирование эритроцитов при -196 °С под комплексной за­ щитой полиэтиленоксида с молекулярным весом 1500 и диметилацетамида, обладающих, соответственно, и экстра- и интрацеллюлярным действием, приводит к изменению распределения клеток по прочности, к увеличению числа более прочных эритроцитов. По-видимому, криофилактики оказывают стабилизирующее действие на клеточные мем­ браны. Судя по ультразвуковым эритрограммам, эритроциты, хранив­ шиеся в течение 5 лет при температуре -196 °С под защитой глицерина 35 %-ной концентрации, лучше переносят хранение, чем эритроциты, хранившиеся в среде, где концентрация глицерина не превышала 30 %. Это хорошо согласуется с известным фактом, что криозащитное дейст­

вие глицерина в определенных пределах пропорционально его концен­ трации в среде.

Ультразвуковая резистентность эритроцитов, хранившихся при -196 °С, непосредственно после размораживания значительно выше, чем их резистентность после 24 ч последующего хранения при +4 °С. В связи с этим можно рекомендовать использовать их в кратчайшие после размораживания сроки.

Нет принципиальных сложностей для измерения ультразвуковой резистентности лимфоцитов, тромбоцитов, сперматозоидов и других клеток. Так, при изучении лизиса форменных элементов крови свиньи в ультразвуковом поле было обнаружено, что в присутствии лейкоци­ тов и эритроцитов тромбоцитопения наступает при более низких ин­ тенсивностях ультразвука, чем при воздействии ультразвуком на чис­ тую тромбоцитарную плазму.

Применение ультразвуковой цитолизометрии для оценки каче­ ства спермы позволило обнаружить различия в механической рези­ стентности сперматозоидов животных разных видов, выявить зако­ номерность, в соответствий с которой устойчивость сперматозои­ дов к механическим воздействиям тем выше, чем больше масса животного. Поэтому неудивительно, что сперма быка обладает большей криорезистентностью, чем сперма кролика, поскольку при замораживании так же, как и при ультразвуковом воздействии, ме­ ханический фактор является одним из приводящих к разрушению и гибели клетки.

Неизвестно, обусловлена ли повышенная прочность сперматозои­ дов крупных животных биологической потребностью, или это обу­ словлено повышенным содержанием холестерина и сфингомиелина во всех клетках крупных животных. Отметим, однако, весьма высо­ кую резистентность сперматозоидов рыб, что, по-видимому, объясня­ ется условиями внешнего оплодотворения.

Ультразвуковая резистентность сперматозоидов коррелирует с их подвижностью и, следовательно, с их оплодотворяющей способно­ стью. Это позволяет быстро и объективно оценивать пригодность спермы для искусственного оплодотворения, отрабатывать щадящие режимы ее хранения при низких температурах, подбирать подходя­ щие криопротекторы.

Этими примерами применение ультразвуковой цитолизомет­ рии не ограничивается. Ш ирокое применение метода позволяет ре­ шать самые разные задачи. Метод ультразвукового разрушения эритроцитов и других клеток значительно информативнее метода определения механической прочности эритроцитов, используемого

в настоящее время в клинической практике, и способен его заме­ нить, по крайней мере, в тех случаях, когда небольшое удорожание анализов оказывается несущественным по сравнению с ценностью получаемой информации.

2.5. СОНОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ В УЛЬТРАЗВУКОВОЙ ДИАГНОСТИКЕ

Ультразвуковое свечение жидкостей зависит от их физико-хими­ ческих свойств: поверхностного натяжения, давления насыщающих паров, вязкости, природы и концентрации растворенных в жидкости веществ и т. д. Поэтому если в результате тех или иных физиологиче­ ских или патологических процессов в сыворотке крови, мочи или дру­ гих биологических жидкостях меняется содержание веществ, влияю­ щих на сонолюминесценцию, то ее можно использовать для исследо­ вания динамики этих процессов и диагностики патологических состояний.

Так, если небольшое количество (6,45 мл) плазмы крови или воды поместить в кювету, дном которой служит ультразвуковой излучатель, то после включения ультразвука интенсивностью 0,05...0,2 Вт/см2 и частотой 500 кГц в жидкости возникает свечение, быстро уменьшаю­ щееся со временем. Скорость уменьшения интенсивности свечения воды всегда одинакова, а скорость уменьшения интенсивности свече­ ния плазмы несколько выше, чем у воды, и заметно различается у больных и здоровых. В качестве диагностического теста удобно поль­ зоваться величиной:

_ ^плазмы

^воды

где йюды - время, в течение которого интенсивность свечения дистил­ лированной воды уменьшается втрое, а Плазмы - время, за которое в три раза уменьшается свечение исследуемого образца плазмы.

Исследования показали, что в норме величина П = 0,75-1,0, при злокачественных патологиях П = 0,016-0,15, а при других заболевани­ ях не падает ниже 0,2. Авторы связывают обнаруженный ими эффект с изменением газосодержания в плазме крови при патологических про­ цессах в организме. При злокачественных новообразованиях содержа­ ние кислорода в плазме не превышает 88 % от нормы. Простота и на­ дежность метода позволяет использовать его для дифференциальной диагностики заболеваний опухолевой и неопухолевой этиологии.