книги / Основы взаимодействия ультразвука с биологическими объектами

Основные нарушения в клетках при криоконсервировании обу­ словлены механическими напряжениями, возникающими в биологи­ ческой среде при замораживании. Следовательно, криорезистент­ ность клеток тем выше, чем выше их устойчивость к механическим воздействиям, а механическую резистентность легко оценить, исполь­ зуя метод ультразвуковых цитолизограмм (см. § 2.4).

При добавлении криопротектора к среде физико-химические свой­ ства раствора стабилизируются не сразу и продолжают меняться в те­ чение нескольких часов или даже суток до тех пор, пока раствор не ста­ нет гомогенным. Воздействие низкочастотным ультразвуком (35 кГц) мощностью 15...100 Вт существенно ускоряет растворение криопротек­ тора в жидких средах и в течение нескольких минут стабилизирует па­ раметры раствора. Даже отстоявшиеся в течение недели растворы криопротективных веществ, например глицерина или полиэтиленоксида, после ультразвуковой обработки становятся более гомогенными, о чем свидетельствуют результаты рентгеноструктурного анализа их заморо­ женных образцов. В разбавителе спермы ультразвук диспергирует ле­ цитин с сохранением его ламелярной структуры, что существенно улучшает качество разбавителя, повышает его защитные свойства.

Клетки и ткани, помещенные в раствор криопротектора, должны выдерживаться в нем до тех пор, пока не будет достигнуто насыщение. Время эквилибрации, т. е. период, в течение которого криопротекгоры насыщают клетку, также может быть сокращено с использованием ультразвука, так как, увеличивая проницаемость клеточных мембран, ультразвук ускоряет процесс переноса веществ через эти мембраны.

Ультразвук может быть полезен и для определения степени насы­ щения клеток в суспензии, а также тканей и органов криопротектором. При перфузии изолированного органа перед низкотемпературной консервацией раствором криопротектора измеряют и сравнивают скорости ультразвука в подводимом к органу и оттекающем от него

растворе (рис. 5.6). Когда происходит

В охлажденном растворе, прежде всего, начинает вымерзать чистая вода, а в незамерзшей части жидкости быстро возрастает концентрация солей, и раствор становится гипертоническим. В та­ кой среде клетки испытывают существенные изменения: они обез­ воживаются, меняется соотношение ионов во внутриклеточной сре­ де. Интенсивно перемешивая жидкую среду как внутри клеток, так и вне их, ультразвуковые микропотоки способствуют равномерно­ му распределению солей и уменьшают вредные последствия пребы­ вания клеток в гипертоническом растворе.

Качество спермы сельскохозяйственных животных, заморожен­ ной в ультразвуковом поле (880 кГц; 0,1...0,2 Вт/см2), после размора­ живания значительно выше, чем качество спермы, криоконсервированной без ультразвукового воздействия. Средняя активность сперма­ тозоидов увеличивается на 1-2 балла, повышается абсолютный показатель живучести и удлиняется промежуток времени, в течение которого сперматозоиды остаются способными выполнять свои био­ логические функции.

Ультразвуковая обработка эритромассы, защищенной криопро­ тектором (глицерином или полиэтиленоксидом), также способствует повышению криорезистентности клеток.

Клетки костного мозга, содержащие ядра, так же, как и безъядерные эритроциты, лучше сохраняются при криоконсервировании с использо­ ванием ультразвука. Сохранность клеток повышается по мере увеличе­ ния интенсивности ультразвукового воздействия до 0.8...0.9 Вт/см2. Ультразвук с частотой 880 кГц эффективнее ультразвука с частотой 2640 кГц. В первом случае различие в сохранности клеток в контрольных

иопытных образцах составляет 12 %, а во втором - 9 %. Ультразвук с ин­ тенсивностью, превышающей 0,9Вт/см2, снижает сохранность клеток. Эффект объясняется тем, что наряду с положительным воздействием на процессы криоконсервирования, ультразвук при высоких интенсивно­ стях способен разрушать клетки в суспензии.

Процесс размораживания при криоконсервировании биологиче­ ского материала не менее важен, чем процесс замораживания, так как физико-химические процессы в обоих случаях сходны, что позволяет

издесь успешно использовать ультразвуковое воздействие. Размораживание в ультразвуковом поле осуществляется при воз­

действии ультразвуком на контейнеры с замороженными клеточными суспензиями, помещенными в водяную баню с температурой 40...45 *С. Оттаивание продолжают до тех пор, пока температура сус­ пензии не достигнет 5...10 'С. Размораживание в ультразвуковом поле способствует повышению сохранности клеток на 20...25 %. Эффект обусловлен не только микротечениями, ускоряющими теплообмен и снижающими температурные градиенты как внутри, так и снаружи контейнеров, но и действием ультразвука, стимулирующим репара­ тивные процессы в клетках.

В последнее время растет интерес к проблеме криоконсервирова­ ния эмбрионов человека и животных. Решение этой проблемы наталки­ вается на ряд трудностей. Так, исследование возможности криоконсер­ вирования ооцитов свиньи выявило их высокую криочувствитель­ ность. Поиск путей сохранения ооцитов при замораживании привел к использованию ультразвука низких интенсивностей для повышения их сохранности. Однако лабильные к замораживанию ооциты оказались чувствительными к ультразвуковому воздействию. Наиболее устойчи­ вы мелкие, незрелые ооциты без четко выраженных гранул в цитоплаз­ ме. Более зрелые клетки средних размеров, характеризующиеся отно­ сительно большой растяжимостью, имеют повышенную чувствитель­ ность к ультразвуку.

Чаще всего наблюдается удаление клеток лучистого венца, неред­ ки разрывы в плазматической мембране, деформация ооцитов, час­ тичная дегидратация и другие нарушения. Обработка ультразвуком с интенсивностью 0,05...0,1 Вт/см2 в течение 0,5 мин в процессе экви­ либрации с криопротектором, а также во время размораживания, уве­ личивает морфологическую сохранность законсервированных ооци­ тов до 65 %, по сравнению с 45 % в контрольных образцах, и способст­ вует их дальнейшему развитию в культуре.

Анализ многочисленных данных о влиянии низких температур и ультразвука на ткани и клетки в суспензии свидетельствует о значи­ тельной роли цитоплазматических мембран в формировании ряда ре­ акций биологических систем на ультразвуковое и криовоздействие. Мембранные структуры способны по-разному реагировать на дейст­

вие каждого фактора, в зависимости от его параметров, и результи­ рующий эффект комбинированного воздействия зависит от того, сум­ мируются ли эффекты их влияния или имеет место частичная или полная взаимокомпенсация.

5.6.2. Влияние ультразвука на биосинтез интерферона

Воздействие ультразвуком низких интенсивностей на клетки в суспензии или культуре может обусловить стимуляцию процессов их жизнедеятельности. Известно, например, что в относительно мягких условиях ультразвуковой обработки (0,05...0,5 Вт/см2; 0,88 МГц; 30 с) ускоряется процесс синтеза соединительнотканого белка в культуре фибробластов.

Представляет практический интерес возможность стимуляции синтеза и ряда других белков в клетках, в частности биосинтеза интер­ ферона в индуцированных вирусом лейкоцитах.

Интерферон синтезируется в клетках организма и в культуре тка­ ней в ответ на воздействие природных и искусственных индукторов - вирусов, эндотоксинов, внутриклеточных паразитов, высоко- и низко­ молекулярных соединений. Помимо антивирусной активности, ин­ терферон проявляет способность подавлять размножение быстроделящихся клеток, обладает иммуномодулирующим действием. Он эф­ фективен как радиозащитное и антитоксическое средство.

Интерферон, будучи важнейшим неспецифическим фактором по­ вышения резистентности, продуцируется почти сразу после попада­ ния индуктора биосинтеза, например вируса, в организм, однако есте­ ственно образующегося интерферона часто оказывается недостаточно для предупреждения развития болезни. Воздействие ультразвуком те­ рапевтических интенсивностей на область локализации патологиче­ ского процесса, очевидно, приводит к стимуляции биосинтеза интер­ ферона. Не исключено, что именно этот эффект лежит в основе ульт­ развуковой физиотерапии вирусных кератитов.

При ряде патологий весьма эффективно введение в организм эк­ зогенного интерферона, полученного либо в результате химического синтеза, либо генно-инженерными методами, либо при его биосинтезе в культуре лейкоцитов, индуцированных вирусом.

Для получения наиболее качественного (лейкоцитарного) интер­ ферона лейкомассу из свежей крови фракционируют, обрабатывают гомологичным интерфероном (проводят прайминг) и индуцируют биосинтез интерферона каким-либо вирусом, например вирусом Сен­ дай или вирусом болезни Ньюкасла. После этого клетки помещают в специально подобранную среду и выдерживают при температуре 37 ®С, постоянно перемешивая. Через 16...18 ч клетки отделяют и вы­ деляют из среды интерферон, активность которого можно оценить по

дукции практически не влияет ни на скорость биосинтеза интерферона, ни на жизнеспособность клеток, оцениваемых по их окрашиваемости красителем трипановым синим. После обработки ультразвуком с интен­ сивностью 0,1 Вт/см2 в суспензии обнаруживается около 10 % погибших клеток. Дальнейшее увеличение интенсивности ультразвука приводит к экспоненциальному росту числа нежизнеспособных (прокрашиваемых) клеток, а после обработки ультразвуком интенсивностью 0,7 Вт/см2 в суспензии остается 65 % жизнеспособных лейкоцитов (рис. 5.8).

Существенное увеличение скорости гибели клеток при интенсив­ ностях ультразвука, превышающих 0,7 Вт/см2, обусловлено кавитаци­ ей, порог возникновения которой зависит от объемной концентрации клеток в среде, в разбавленных суспензиях совпадает с порогом кави­ тации в воде (0,3 Вт/см2) и становится весьма значительным, если объем частиц в суспензии превышает 2 %. Согласно теоретическим оценкам и экспериментальным данным, порогу кавитации в суспен­ зии лейкоцитов, содержащей 3 • 106 кл./см3, соответствует интенсив­ ность ультразвука 0,6 Вт/см2.

Облучение ультразвуком суспензии лейкоцитов в течение 5 мин с интенсивностью от 0,05 до 0,6 Вт/см2 приводит к увеличению на 30 % количества интерферона, синтезируемого жизнеспособными клетками. Дальнейшее увеличение интенсивности ультразвука обусловливает рез­ кое снижение количества синтезированного интерферона (в пересчете на жизнеспособные клетки). Ультразвук, интенсивность которого превыша­ ла 1 Вт/см2, приводил к практически полному подавлению биосинтеза (рис. 5.9), хотя, как было указано выше, в этих условиях около половины исходного количества клеток в суспензии не прокрашивается трипано­ вым синим, т. е. они являются, судя по этому, вполне жизнеспособными.

терферона, синтезируемого лейкоци­ тами в суспензии, не поддается однозначной интерпретации.

Увеличение интенсивности ультразвука в интервале от 0,1 до 0,6 Вт/см2 повышает скорость биосинтеза интерферона, но одновре­ менно снижает число жизнеспособных клеток. Поэтому суммарный эффект невелик.

Обычно клетки, единожды использованные для синтеза интерфе­ рона, выбрасывают, так как при повторном использовании они дают незначительное количество препарата. Однако после трехминутного ультразвукового воздействия на «отработанные» клетки наблюдается стимуляция повторного синтеза интерферона (табл. 5.2). Максималь­ ный выход препарата может быть получен при интенсивности ультра­ звука 0,01...0,2 Вт/см2. Ультразвук с интенсивностью выше 0,7 Вт/см2 резко ингибирует повторный синтез интерферона.

Таблица 5.2

Зависимость выхода интерферона (по активности препарата в международных единицах)

от интенсивности ультразвукового воздействия на суспензии однократно использованных для биосинтеза лейкоцитов

Применение ультразвука для стимуляции позволяет на 20...25 % увеличить выход продукта и делает практически целесообразным по­ вторное использование лейкоцитов.

Полученный очищенный интерферон хранят либо в виде раствора, либо в виде лиофильно высушенного препарата. При длительном хра­ нении активность интерферона медленно снижается, что обусловлено

Если после воздействия ультразвуком добавить в среду митоген, то его эффективность возрастает во много раз, и для достижения того же эффекта потребуется на порядок меньше митогена.

5.6.4.Предынкубационная обработка яиц ультразвуком

ивведение лекарственных веществ через неповрежденную

скорлупу

Используя ультразвуковые методы для предынкубационной обра­ ботки яиц, можно получить ряд полезных для птицеводства эффектов.

Предынкубационная очистка поверхности яиц в низкочастотных 22...44 кГц ультразвуковых ваннах длится 30...60 с. Качество белка при этом не меняется, а уничтожение микрофлоры на скорлупе способству­ ет увеличению выводимости цыплят. Следует, однако, отметить, что чрезмерное повышение мощности ультразвука, способствующее уско­ рению очистки и повышению ее качества, может привести к наруше­ нию процесса развития эмбрионов, снижению выводимости, увеличе­ нию количества цыплят с врожденными уродствами.

Кратковременное воздействие высокочастотным ультразвуком (880 кГц) невысокой интенсивности на яйцо перед инкубацией приво­ дит к увеличению выводимости цыплят (табл. 5.3).

Таблица 5.3

Выводимость цыплят (в процентах) после воздействия высокочастотным ультразвуком на яйцо перед инкубацией в течение 10 с

(300 яиц на каждый опыт)

Наилучшие результаты достигаются при интенсивности ультра­ звука 0,4 Вт/см2 и десятисекундной длительности обработки. Следует отметить, что, чем выше инкубационное качество яиц, тем меньше проявляется стимулирующее действие ультразвука. Очевидно, при низкой исходной выводимости значительным оказывается резерв рос­ та и развития, который и реализуется при неспецифическом ультра­ звуковом воздействии.

В практическом птицеводстве для профилактики заболеваний и массовой гибели цыплят в инкубационное яйцо вводят различные ле­ карственные вещества, в том числе антибиотики. Самый простой и распространенный способ введения антибиотиков - прокалывание скорлупы шприцем, последующее введение раствора в воздушную ка­ меру и герметизация яйца. Этот способ позволяет легко дозировать лекарство, но требует строгой стерильности и практически не подда­ ется автоматизации.

Аналогичным способом на 18-е сутки инкубации при переносе яиц в выводные шкафы в яйцо вводят вакцину, например, против бо­ лезни Марека, что позволяет избавиться от трудоемкой и малопроиз­ водительной операции введения вакцины внутримышечно каждому цыпленку всего поголовья молодняка.

5.6.5. Снижение уровня иммунологической специфичности клеток

В последнее время все шире используется трансфузия отдельных компонентов крови - эритроцитарной, лейкоцитарной, тромбоцитарной массы, плазмы, альбумина, что позволяет при ряде патологиче­ ских состояний достичь значительно большей терапевтической эф­ фективности, чем при переливании цельной крови.

Следует, однако, отметить, что ветеринарная гемотрансфузиоло­ гия сопряжена с определенными сложностями в связи с большим чис­ лом групп крови у животных. У коров, например, не менее 11-ти, у ло­ шадей более девяти, у овец - семь, а у свиней обнаружено 14 групп крови. Встречаются животные, кровь которых не относится ни к од­ ной из известных групп.

Групповая специфичность клеток крови обусловлена антигенны­ ми детерминантами, представляющими собой гликопротеиды и гликопротеидные комплексы, расположенные на наружной поверхности цитоплазматической мембраны. Эти детерминанты играют основную роль в иммунологическом распознавании «своих» и «чужих» клеток, а следовательно, и в трансплантационной совместимости тканей, в том числе крови и ее форменных элементов.

Иммунологическая несовместимость может быть снижена или преодолена, если частично или полностью удалить антигенные детер­ минанты с клеточной поверхности.

Обработка эритроцитов гликолитческими ферментами, отщепляю­ щими полисахаридный остаток антигенных детерминант, весьма пер­ спективна, но практически неосуществима в настоящее время в связи с отсутствием необходимых ферментов требуемой чистоты и специфич­ ности. Возможна и химическая модификация группоспецифичных ан­ тигенов с целью их полной инактивации, но свойства полученных при этом эритроцитов остаются пока непредсказуемыми. Этих недостатков лишен ультразвуковой метод, позволяющий механически удалять группоспецифичные антигены с мембран эритроцитов и других клеток.

В поле ультразвука докавитационных интенсивностей возникают микропотоки, обеспечивающие «смывание» (десорбцию) с поверхно­ сти клеток молекул белков и других биополимеров, что подтверждает­ ся изменением энзиматической активности клеток, потерей ими свя­ занных с мембранами антигенов, появлением в среде, в которой сус­ пендированы клетки, заметных количеств гликопротеидов. Во