книги / Основы взаимодействия ультразвука с биологическими объектами

гих сложных лекарственных препаратов. В то же время трансмем­ бранный транспорт ряда жизненно важных для клетки веществ осу­ ществляется специальными, присутствующими в мембранах клетки переносчиками. Такой транспорт по градиенту концентрации, не тре­ бующий затраты энергии, называют облегченной диффузией.

При облегченной диффузии, так же, как и в случае простой диф­ фузии, ультразвуковые микропотоки, перемешивая среду, частично снимают диффузионные ограничения и ускоряют перенос веществ. Это подтверждается ускорением поглощения эритроцитами глюкозы из инкубационной среды при облучении суспензии клеток ультразву­ ком с интенсивностью 0,1 Вт/см2

При активном транспорте перенос молекул через мембрану осу­ ществляется против градиента концентрации с затратой энергии. Дей­ ствие ультразвуковых микропотоков снижает эффективность транс­ портировки веществ. В этом случае поток частиц, например ионов на­ трия, складывается из двух слагаемых:

нарных условиях равны. Под влиянием ультразвука / ДИф увеличивается, а в лучшем случае не изменяется. В результате нарушается рав­ новесие ионов на мембране, изменяется ее потенциал.

В этих рассуждениях не учитывалось действие ультразвука на структуру самой мембраны. Между тем, ультразвуковые потоки способ­ ны «смывать» с поверхности мембран биомакромолекулы (см. §§ 1.10 и 3.2). Это меняет условия экранировки зарядов на мембранах и влияет на их проницаемость и условия диффузии ионов через мембраны.

Интенсивные микропотоки способны нарушать целостность кле­ точных мембран, через разрывы в которых частично или полностью вытекает содержимое клеток. Этот случай может рассматриваться как предельный случай изменения условий транспортировки веществ че­ рез клеточную мембрану при ультразвуковом воздействии.

При нагревании за счет перехода энергии ультразвука в теплоту разность температур между центром клетки и ее периферией при ин­ тенсивности ультразвука Вт/см2 по расчетам составляет 10~3 К, а гра­ диент температур - 2...5 град/см. Следовательно, в этих условиях ока­ зывается возможным изменение скоростей потоков веществ в результа­ те термодиффузионного переноса как внутри клетки, так и через клеточную мембрану.

Потенциал Дебая (вибропотенциал), возникающий в суспензиях клеток и тканях под влиянием ультразвука, используемого в терапев­ тической практике, достигает 10 мВ, т. е. величин, сравнимых со зна­ чениями потенциалов клеточных мембран.

При кавитации, когда интенсивность ультразвукового излучения превышает 0,3 Вт/см2, на клеточные мембраны наряду с ударными волнами, энергичными микропотоками и потенциалами Дебая, могут влиять свободные радикалы, азотная и азотистая кислоты, а также пе­ рекись водорода.

Таким образом, изменение проницаемости клеточных мембран - универсальная реакция на ультразвуковое воздействие, независимо от того, какой из факторов ультразвука, действующих на клетку, прева­ лирует в том или ином случае.

Нарушение состава внутриклеточной среды и микроокружения клетки не может не отразиться на скорости биохимических реакций с участием ферментов, весьма чувствительных к содержанию в среде тех или иных ионов, продуктов ферментативных реакций и некоторых других веществ.

Суммируя, можно предложить следующий механизм действия ультразвука на клетки. Физико-химические ультразвуковые эффекты в среде (механические, тепловые, электрические, химические) -» нару­ шение микроокружения клеточных мембран (снижение градиентов концентраций различных веществ возле мембран, обратимая десорб­ ция молекул с их поверхности, изменение мембранного потенциала, об­ ратимое уменьшение вязкости внутриклеточной среды) -» изменение проницаемости клеточных мембран (ускорение диффузии, изменение эффективности активного транспорта, нарушение целостности мем­ бран) -» нарушение состава внутри- и внеклеточной среды —» измене­ ние скоростей ферментативных реакций в клетке (небольшая актива­ ция и преимущественное подавление ферментативных реакций в клет­ ках вследствие изменения оптимальных для функционирования ферментов концентраций веществ) —> развитие репаративных реакций в клетке, связанных с синтезом других веществ (синтез РНК и новых ферментов, продуцируемых клеткой для компенсации возникшего не­ достатка в продуктах ферментативных реакций) —>...

Из анализа этой схемы - результата существенных упрощений - следует, что специфичным в действии ультразвука на биологические системы является изменение микроокружения клеточных мембран, приводящее к нарушению процессов переноса веществ через мембра­ ны. Дальнейшая цепочка процессов может быть инициирована и дру­ гими физико-химическими факторами, приводящими к аналогичным нарушениям, в частности, к увеличению проницаемости клеточных мембран.

3.4. ДЕЙСТВИЕ УЛЬТРАЗВУКА НА МНОГОКЛЕТОЧНЫЕ СИСТЕМЫ

Ткани, органы и весь организм - это не просто сумма клеток, но сложная, иерархически организованная система, в которой клетка яв­ ляется простейшей подсистемой, способной в определенных условиях к самостоятельному существованию.

Реакция на локальное ультразвуковое воздействие, наблюдаемая на уровне целостного организма, представляет собой результат ряда последовательных процессов.

3.4.1. Пороги биологического действия ультразвука

Возмущения, не превышающие определенной (пороговой) вели­ чины, не приводят к видимым последствиям в биологической системе, потому что компенсируются специальными механизмами.

Очевидно, что во всех случаях первичная реакция биологических систем на ультразвуковое воздействие происходит на клеточном уровне.

Пороговой для биологического действия ультразвука является та­ кая его интенсивность (при прочих неизменных его параметрах - час­ тоте, времени и режиме воздействия), ниже которой не меняется про­ ницаемость клеточных мембран, а следовательно, не начинаются регу­ ляторные и репаративные процессы в клетках, направленные на ликвидацию последствий, вызванных указанными изменениями.

Судя по данным ряда исследователей, пороговая интенсивность не превышает 10 мВт/см2. Очевидно, что данный порог и является ис­ тинным порогом биологического действия ультразвука. Оценить его проще всего по электропроводности тканей, изменения которых мож­ но наблюдать при интенсивностях ультразвука более 10 мВт/см2.

В некотором интервале более высоких интенсивностей ультра­ звука при относительно кратковременном воздействии (до 103 с) возникающие в клеточных мембранах нарушения, как правило, не приводят к видимым изменениям в структуре и функционировании клеток и тканей. Это обусловлено развитием регуляционных про­ цессов, компенсирующих последствия повышения проницаемости мембран непосредственно во время ультразвукового облучения. Верхняя граница интервала интенсивностей, превышение которой приводит к появлению не репарируемых при ультразвуковом воз­ действии изменений, может быть принята в качестве еще одного, регистрируемого, порога биологического действия ультразвука. Этот порог соответствует такому значению интенсивности ультра­ звука, выше которого могут наблюдаться морфологические, элек­ трофизические, физиологические и другие изменения в биосисте­

мах, облучаемых ультразвуком в течение 1...103 с, как в процессе воздействия, так и после него.

Значение регистрируемого порога зависит от природы регистрируе­ мого параметра, состояния биологической системы, длительности воз­ действия. Так, небольшая деполяризация мембран клеток ацетабулярии наблюдается при интенсивности ультразвука 0,1 Вт/см2, а потенциал действия возникает при интенсивностях, превышающих 0,2 Вт/см2; ус­ тойчивость к ультразвуку клеток дрожжей, находящихся в среде без глю­ козы, значительно выше, чем в среде, содержащей глюкозу.

Регистрируемому порогу чаще всего соответствует интенсивность ультразвука 0,1 Вт/см2 (0,8...2 МГц; 1...103 с). При интенсивностях, превышающих 0,1 Вт/см2, наряду с увеличением влияния микропото­ ков заметную роль начинают играть и другие факторы - в основном, выделяющаяся при ультразвуковом воздействии теплота и вибропо­ тенциалы. В определенном интервале интенсивностей наблюдаемые биологические эффекты, возникающие при ультразвуковом воздейст­ вии, обратимы. Верхняя граница этого интервала может быть принята в качестве третьего порога. Ее превышение приводит к выраженным деструктивным изменениям, на фоне которых репаративные процес­ сы в клетках невозможно обнаружить.

Все три порога достаточно условны и зависят от особенностей строения клеточных мембран, специализации клеток и состояния их репаративных систем, а также от свойств окружающей клетку среды. Какой из этих порогов принять за порог биологического действия ультразвука зависит от того, что принимается за результат действия ультразвука на биологическую систему.

Если результатом считать стимулирование репаративных реак­ ций клетки в результате незначительного нарушения микроокруже­ ния клетки и увеличения проницаемости ее мембран, то порог биоло­ гического действия ультразвука весьма мал (10 мВт/см2).

Если результатом действия ультразвука считать биологически зна­ чимые эффекты - регистрируемые изменения, наблюдаемые во время и после ультразвуковой обработки, то, как следует из анализа данных научной литературы, порог примерно равен 0,1 Вт/см2, хотя величина его и зависит от длительности облучения. Если время воздействия меньше 200 с, то для получения регистрируемого биологического эф­ фекта требуются более высокие интенсивности ультразвука.

Полагают, что биологический эффект возникает в тканях млеко­ питающих лишь в том случае, если произведение усредненной по времени и максимальной в пространстве интенсивности ультразвука I на время воздействия I превышает 50 Дж/см2. Это суждение осно­ вано на предположении, что биологические ультразвуковые эффек­ ты имеют, в основном, тепловую природу, так как повышение темпе­ ратуры ткани под действием ультразвука с частотой 1 МГц составит

2...4 °С, если выполняется условие И = 50 Дж/см2 и коэффициент по­ глощения ультразвука порядка 0,1 Нп/см.

Однако эта простая схема противоречит некоторым оценкам. Так, при различных интенсивностях и времени воздействия, но

при равных I • I ткани, различающиеся по коэффициенту поглощения ультразвука, нагреваются до разных значений температуры. Различ­ ные условия теплоотвода из облучаемой области ввиду разницы в ко­ личестве кровеносных сосудов, скорости кровотока и теплопроводно­ сти тканей также определяют различную степень нагревания тканей при равной подводимой энергии. Поэтому один лишь тепловой меха­ низм не объясняет существования пороговых условий:

И - 50 Дж/см2 и /пор = 0,1 Вт/см2.

Коэффициент поглощения ультразвука прямо пропорционален час­ тоте ультразвука и существенно изменяется в диапазоне 0,5... 1,5 МГц. Между тем, пороговые условия не учитывают зависимость эффекта от частоты, что также противоречит предположению о тепловой природе ультразвукового повреждения. Кроме того, биологические эффекты, обусловленные ультразвуком, как правило, не удается имитировать теп­ ловым воздействием. Противоречат этому и многие экспериментальные данные. Так, облучение мышей ультразвуком (0,93 МГц; 5 мин) на 15-й день беременности увеличивает предродовую смертность эмбрионов. Послеродовая смертность не наблюдается, хотя четко прослеживаются нервно-мышечные нарушения. Интенсивность ультразвука, при которой возникают эти нарушения, не превышает 10 мВт/см2.

Импульсный ультразвук с интенсивностью в импульсе 10 Вт/см2 (2 МГц) вызывает гибель личинок дрозофилы, хотя средняя по време­ ни и пространству интенсивность не превышает 3 мВт/см2, что, на пер­ вый взгляд, гарантирует отсутствие биологических эффектов. Разнооб­ разие эффектов, обнаруживаемых при низких интенсивностях ультра­ звука, позволяет предположить, что интенсивности 10 мВт/см2 еще далеки от пороговых. Однако кратковременное применение ультразву­ ка низкой интенсивности для диагностических целей, видимо, не вызы­ вает заметных последствий. К этому выводу пришла специальная ко­ миссия, изучившая экспериментальные данные, полученные на живот­ ных, и результаты наблюдений за детьми и их матерями, которые во время беременности исследовались с помощью ультразвуковых диагно­ стических методов.

Кажущееся противоречие - отсутствие биологического эффекта при кратковременном воздействии и явные нарушения при длительном дей­ ствии ультразвука тех же и даже меньших интенсивностей - становится понятным, если предположить, что в одном случае репарационные меха­ низмы успевают справиться со скрытыми нарушениями, а в другом воз­ действие приводит к перенапряжению репарационных систем.

Если результатом биологического действия ультразвука считать деструктивные изменения, то порог ультразвукового действия совпа­ дает с порогом кавитации в среде или с такими параметрами ультра­ звука, которые обеспечивают повышение температуры до 43...45 ®С. Этот порог широко варьируется в зависимости от факторов, влияю­ щих на порог кавитации в среде (величины облучаемого ультразвуком объема, вязкости среды, ее гетерогенности и т. д.), или условий тепло­ обмена в облучаемой ультразвуком области.

3.4.2. Ультразвуковые эффекты в мягких тканях

Ультразвук, иснользуемый в терапевтических целях (0,7...3 МГц; 0.1...2 Вт/см2; 3...10 мин), вызывает в тканях организма разнообразные изменения.

При относительно низких интенсивностях, лишь ненамного превы­ шающих пороги чувствительности к ультразвуку для конкретных тка­ ней, наблюдается ускорение обменных процессов и стимулирование за­ щитных механизмов. Так, ультразвук (1МГц; 0,1 Вт/см2; 5 мин), исполь­ зуемый 3 раза в неделю, ускоряет процесс регенерации ткани уха кролика после хирургического вмешательства. Параллельно в регенери­ рующей ткани ускоряется процесс связывания, например, меченого тимидина. Обмен катехоламинов в организме также заметно возрастает.

При этих же параметрах ультразвук влияет на различные биохими­ ческие процессы в организме. Ультразвук (1 МГц; 0,2 Вт/см2; 5...10 мин) вызывает изменения окислительно-восстановительного потенциала тканей, уменьшение содержания аскорбиновой кислоты, ускорение биосинтеза порфиринов и тиронинов, увеличение содержания нуклеи­ новых кислот в тканях, изменение активности ферментов, заметные из­ менения содержания макроэргических соединений - АТФ, фосфокреатина, гликогена, а также микро- и макроэлементов.

Более высокие интенсивности ультразвука (0,3 Вт/см2) приводят к нарушениям структуры и ультраструктуры облучаемых тканей.

Особое внимание уделено исследователями изменению электро­ физических свойств кожных покровов под действием ультразвука. Та­ кое внимание обусловлено практической необходимостью изучить механизмы фонофореза лекарственных веществ через кожу и, по воз­ можности, оптимизировать этот процесс.

Исследования показали, что под влиянием ультразвука (0,9 МГц; 0Д...2 Вт/см2; 5...15 мин) повышается проницаемость как изолирован­ ной кожи, так и кожи в составе организма. В последнем случае эффект значительно выше и зависит от интенсивности ультразвука и природы исследуемых веществ.

Наиболее эффективен ультразвук для увеличения проницаемости покровных тканей по отношению к ионам Ыа, К, 1л, С1, Вг и пр. По от­

ношению к сложным ионам и высокомолекулярным соединениям эф­ фект значительно ниже. Однако во всех случаях проницаемость кожи увеличивается с увеличением интенсивности ультразвука до 1 Вт/см2. При более высоких интенсивностях ультразвук заметно повышает проницаемость кожи для Ыа, К, Са, С1, практически не влияя на ско­ рость переноса ионов сложной структуры.

Полученные эффекты связывают с изменением морфологических особенностей кожного покрова, вызванным ультразвуковым облучени­ ем, и отмечают разрыхление эпидермиса, увеличение количества актив­ ных потовых и сальных желез, а также увеличение диаметра выводных протоков кожных желез в 2-4 раза. Данные многих авторов, в основ­ ном, совпадают с приведенными выше, однако имеются сведения, что предварительное облучение ультразвуком (0,8 МГц) в интервале ин­ тенсивностей 0,2... 1 Вт/см2 понижает скорость электрофореза адрена­ лина и ацетилхолина через неповрежденную кожу, тогда как ультразвук более высоких интенсивностей повышает ее. Ультразвук (0,8 МГц; 0,2... 1 Вт/см2) обратимо ускоряет как пассивный, так и активный транс­ порт ионов № , К, Са через кожу лягушки. Пороги эффекта лежат в об­ ласти 0,2 Вт/см2. Однако если ускорение пассивного транспорта начи­ нается сразу после включения ультразвука, изменения в скорости ак­ тивного транспорта фиксируются только через 3...4 мин.

Наряду с проницаемостью изменяются и электрические свойст­ ва кожи.

Уже при интенсивности ультразвука 0,2 Вт/см2 (0,9 МГц) регист­ рируют относительные изменения трансмембранного потенциала изо­ лированной кожи лягушки. С увеличением интенсивности ультразву­ ка эта величина возрастает с 0,01 до 0,4 при интенсивности 1 Вт/см2. При интенсивностях менее 2 Вт/см2 потенциал кожи снижается после включения ультразвука, а затем восстанавливается до исходных зна­ чений. При более высоких значениях интенсивности вторая фаза от­ сутствует, что свидетельствует о необратимых изменениях в коже. Модулирование ультразвука усиливает эффект на 15...20 % при часто­ тах модуляции 10...20 и 200 Гц.

Если в среду, омывающую кожу, добавлен цианистый калий, пре­ кращающий обмен веществ, то никакого изменения потенциалов под действием ультразвука не происходит.

Фокусированный ультразвук (1 МГц, 1...100 Вт/см2) в условиях хо­ рошего теплообмена и отсутствия кавитации вызывает обратимое уменьшение потенциала изолированной кожи лягушки и пропорцио­ нальное интенсивности ультразвука возрастание тока короткого замы­ кания. С увеличением длительности облучения ток короткого замыка­ ния постоянно увеличивается, в то время как изменения мембранного потенциала приходятся на первые 0,5 с облучения и в дальнейшем ос­ таются на новом стационарном уровне.

Совокупность приведенных данных свидетельствует о существен­ ной роли клеточных мембран в формировании эффекта изменения электрических свойств тканей в ответ на ультразвуковое воздействие.

Исследование реакции других животных и растительных тканей на ультразвуковое воздействие лишь подтверждает это. Особенно на­ глядно способность ультразвука изменять проницаемость клеточных мембран проявляется в ткани клубня картофеля.

Ткань клубня картофеля - удобная модель для исследований. Она имеет биологическую природу и клеточное строение, а отсутствие рефлекторных и сосудистых реакций существенно упрощает наблю­ даемую картину. В клетках клубня картофеля содержится крахмал, который можно использовать как естественный внутриклеточный ин­ дикатор на йод. Однако при исследовании ионной проницаемости в клетку могут попасть лишь ионы йода, не дающие в комплексе с крах­ малом характерной сине-фиолетовой окраски. Окрашивание наступа­ ет при «проявлении» образцов в 1...2 %-ном растворе перекиси водо­ рода. Механизм проявления сводится к тому, что ионы йода, окисля­ ясь, переходят в атомарный йод, который при взаимодействии с крахмалом, находящимся в пластидах внутри клеток, дает характер­ ную сине-фиолетовую окраску.

Использование ткани клубня картофеля позволяет определить не­ которые закономерности процессов фонофореза ионов йода в ткань, а также исследовать различия между процессами электро- и фонофореза.

Для исследования образцы диаметром 20 мм и высотой 15 мм из клубня картофеля помещали в кювету, дном которой служил излуча­ тель ультразвука (рис. 3.15, а). Специальная подставка обеспечивала постоянное расстояние между поверхностью излучателя и образцом. В кювету заливали 0,5 моль раствор К1 так, чтобы только нижний край образца оказался в контакте с раствором.

Рис. 3.15. Процессы:

а - фонофореза аионов йода о ткань клубня картофеля (1 - термостатируемая кювета; 2 - образец; 3 - раствор йодистого калия); б - электрофореза (1 - электроды;2 - образец;3 - прокладка,смоченная раствором йодистого калия)

ионы йода в ткань под действием ультразвука (0,88 МГц), пропорциональна интенсивности ультразвука и времени облучения (рис. 3.16).

Пороговые интенсивности ультразвука, при которых начинает увеличиваться проницаемость клеточных мембран ткани клубня кар­ тофеля, были определены экстраполяцией экспериментальных зави­ симостей и оказались равными 0,3...0,4 Вт/см2 независимо от времени облучения образцов.

Повышение температуры образцов до 45 °С лишь незначительно влияет на скорость фонофореза, хотя при более высоких температурах эффект заметно возрастает. Следовательно, по крайней мере в интер­ вале температур 20...45 °С проницаемость клеточных мембран увели­ чивается не в результате теплового эффекта ультразвука. По-видимо­ му, в тканях, так же, как и в суспензиях клеток, эффект повышения проницаемости клеточных мембран обусловлен, в основном, акусти­ ческими потоками.

Для сравнения эффектов электрофореза и фонофореза в цилинд­ рические образцы, вырезанные из клубня картофеля, в течение 20 мин электрофоретически вводились ионы йода. Затем образцы ополаски­ вали и разрезали на две части по оси цилиндра и одну половину облу­ чали ультразвуком (0,6 Вт/см2; 5 мин). После этого обе половинки бы­ ли «проявлены* в растворе перекиси водорода. Оказалось, что в той половинке (контрольной), в которую ионы йода были введены элек­ трофоретически, окрасился в характерный сине-фиолетовый цвет лишь тонкий поверхностный слой, где клетки ткани были разрушены механически при подготовке образца; вторая же половинка, дополни­

тельно подвергнутая ультразвуковому воздействию, изменила окра­ ску во всем объеме.

Следовательно, при электрофорезе йод проникает в глубь ткани, но в клетки не попадает, так как сопротивление межклеточной жидкости постоянному току значительно ниже, чем сопротивление клеточных мембран. При следующей после электрофореза ультразвуковой обра­ ботке ткани проницаемость клеточных мембран увеличивается, и крах­ мал, находящийся в пластидах внутри клеток, оказывается доступным для ионов йода. Если образец предварительно обработать ультразву­ ком, а затем провести электрофорез ионов йода, то после проявления весь он окажется окрашенным.

Изменения в проницаемости клеточных мембран носят обрати­ мый характер, если интенсивность ультразвука, обусловившего эти изменения, не превышает 0,8... 1,2 Вт/см2. Повышенная проницае­ мость клеточных мембран сохраняется в течение 1.5...2 ч после воздей­ ствия ультразвуком. Проницаемость весьма значительна в течение первых 20 мин, а затем довольно быстро убывает.

Анализ приведенных данных свидетельствует о том, что при элек­ трофорезе ионы глубоко проникают в ткань, но остаются в межклеточ­ ной среде и не попадают в клетки; при фонофорезе ионы проникают в- ткань на меньшую глубину, но легко проникают внутрь клеток через ци­ топлазматическую мембрану, проницаемость которой повышена ультра­ звуком. При этом следует иметь в виду, что даже при 0,1...0,4 Вт/см2 про­ ницаемость клеточных мембран в тканях животных заметно увеличива­ ется, а дальнейшее повышение интенсивности может обусловить такие эффекты, как перегрев тканей или кавитацию.

Эти данные представляются весьма важными при выборе метода введения лекарственного вещества сквозь неповрежденную кожу. Очевидно, при необходимости повысить локальную концентрацию лекарственного вещества в ткани, например, при терапии опухолевых заболеваний, предпочтительнее метод фонофореза и его сочетание с электрофорезом. Если же необходимо ввести вещество в ткань более диффузно, то в этом случае эффективнее электрофорез.

Приведенные результаты послужили основанием для оптимизации фонофореза гидрокортизона при болезнях суставов. Оказалось, что сни­ жение интенсивности ультразвука с используемых обычно 0,8 Вт/см2 до 0,2...0,4 Вт/см2 в непрерывном режиме и до 0,2...0,3 Вт/см2 в импульсном режиме воздействия (0,88 МГц; 3...5 мин) ускоряет выздоровление при суставной патологии и способствует нормализации цитологических и биохимических показателей синовии. Гидрокортизон при этом депони­ руется в синовиальной жидкости. Такой же клинический эффект полу­ чен при фонофорезе гидрокортизона ультразвуком низких интенсивно­ стей (0,2...0,5 Вт/см2) при пролифератах, десмоидитах, тендинитах и фиброзных периартритах у собак, крупного рогатого скота и лошадей.