Цитология (Э.К.Гасымов)

33

Если в процессе простой и облегченной диффузии ионы и молекулы перемещаются сквозь плазмолемму со стороны большего электрического заряда (потенциала) или большей концентрации в сторону меньшего, то такое перемещение называется пассивным транспортом (рис.2.13 – 1,2,3).

Если ионы и молекулы проникают сквозь клеточную мембрану в обратном (от малого к большему) направлении разницы потенциала и концентрации, то такой процесс, не зависимо от его механизма, носит название активного транспорта. Данный процесс осуществляется непосредственно с помощью энергии, образованной во время гидролиза макроэргических молекул [аденозинтрифосфат (АТФ) или гуанозинтрифосфат (ГТФ)] и называется первичным активным транспортом, а белки участвующие в этом процессе называются насосами (рис.2.13 - 4).

Если активная проницаемость осуществляется посредством белков-переносчиков благодаря энергии, высвободившейся в результате образования электрохимического градиента (разницы) в

обнаружена третья группа белков, которая участвует в переносе ионов, молекул воды и глицерина. Называются они соответственно ионными и водными каналами.

Таким образом, белки плазмолеммы, обеспечивающие ее избирательную проницаемость и имеющие свойственные им особенности, можно разделить на три большие группы:

1.насосы;

2.каналы;

3.переносчики.

Насосы

Большинство насосов обеспечивающих перемещение ионов и молекул против разницы концентрации и потенциала (более чем в 100 раз) являются ферментами, с АТФ-азной активностью. В данный момент, в эукариотических клетках, различают следующие АТФ-азы:

АТФ-азы Р-типа АТФ-азы F-типа АТФ-азы V-типа

АТФ-азы АВС-типа (АТФ Соединяющие Кассеты)

АТФ-азы Р- типа

К АТФ-азам Р-типа относятся:

Na+/K+ - АТФ-азы, находящиеся на клеточной мембране всех живых существ

Са2+ - АТФ-азы, находящиеся в составе биомембран плазмолеммы и эндоплазматической сети. Н+/К+ - АТФ-азы, находящиеся в составе плазматической мембраны клеток желудка и почек. Na+/K+ насосы были обнаружены Скоу в 1957-ом году во время изучения влияния некоторых

катионов на периферические нервные АТФ-азы. Несмотря на то, что данное открытие не было в свое время достойно оценено (Скоу благодаря этому открытию стал лауреатом Нобелевской премии лишь спустя 40 лет), дальнейшие исследования показали, что большинство процессов, протекающих в клетке,

34

происходят благодаря энергии трансмембранного потенциала (электрохимического), образующегося в результате деятельности Na+/K+ насосов (рис.2.13 - 5).

Na+/К+-АТФ-азы будучи интеграль-ными белками, состоят из α-субъединицы и β-гликопротеина. Необходимые для деятельности насоса АТФ, Na+ и К+ катионы, а так же подвергающиеся процессу фосфорилирования остатки аспарагиновой кислоты, располагаются на α-субъеденице. Процесс присоединения 3Na+ (рис.2.14 -1) к обращенной в сторону цитоплазмы поверхности Na+/K+ насоса является причиной гидролиза молекулы АТФ и фосфорилирования (рис.2.14 -2) α-субъединицы. В результате этого часть насоса, соединенная с Na+, подвергаясь конформационному изменению, переворачивается в сторону наружной поверхности клетки и таким образом обеспечивает выход Na+ из клетки (рис.2.14 -3).

В то же время, присоединение 2К+ к части развернувшейся в сторону наружной поверхности клетки (рис.2.14 -4) является причиной отсоединения фосфатной группы от α-субъединицы (дефосфорилирование) (рис.2.14 -5). Тогда насос, вернувшись в свое первоначальное состояние, обеспечивает перемещение К+ в клетку (рис.2.14 -6). Таким образом Nа+/К+ насос при помощи энергии, высвободившейся в результате гидролиза одной молекулы АТФ, способен переместить 3Na+ - из клетки и 2К+ - в клетку против электрохимического градиента.

Для того чтобы отчетливо показать важность деятельности Na+/K+ насоса, следует отметить выраженную разницу распределения молекул, несущих положительный и отрицательный заряд, в плазмолемме снаружи и внутри клетки (табл. 2.1). Как следует из таблицы, с внешней стороны клеточной мембраны преобладают ионы Na+, Cl- и Са2+, а с внутренней – К+ и органические вещества, несущие положительный заряд (аминокислоты, нуклеотиды, сахара, макромолекулы).

При отсутствии такого равновесия осмотическое давление, создаваемое органическими веществами, стало бы причиной притока жидкости в клетку и нарушения, тем самым ее целостности. Вместе с тем, следует учитывать частые изменения количества органических веществ в клетке в зависимости от протекающих в ней процессов. В таком случае ясно видна роль Na+/K+ насосов в поддержании стабильности объема клетки. Разница, образующаяся при распределении катионов во время работы Na+/K+ насосов, является источником энергии для протекания вторично активного транспорта. Результатом этого является то, что более 25% АТФ, синтезируемых в клетке, расходуется в процессе деятельности Na+/K+ насосов.

Na+/K+ насосы также имеют крайне важную роль при распространении электрических сигналов в нервных и мышечных клетках.

Участие ионов Са2+, как вторичных посредников, в различного рода процессах, идущих внутри клетки, требует поддержания их концентрации внутри цитозоля на очень низком уровне. Это требование осуществляется благодаря находящимся в составе клеточной мембраны Са2+ АТФ-азным ферментам (насосам). Данный насос, имеет схожую с Na+/К+ насосом α-субъединицу и подвергаясь конформационному измене-нию, происходящему благодаря энергии высвободившейся в результате гидролиза одной молекулы АТФ, выводит Са2+ из клетки, а Н+ перемещает внутрь клетки.

Насосы Са2+ аналогичного строения расположены также в стенке саркоплазматической сети мышечных волокон. В результате деятельности данных насосов Са2+, находящийся в цитозоле, перемещается в полость саркоплазматической сети, которая служит для них амбаром, а 2Н+ напротив, перемещается в цитозоль.

35

В результате деятельности данных насосов уровень Са2+ в цитозоле поддерживается в нужном количестве, а Н+, попавший в цитозоль, либо выводится из клетки с помощью белков-переносчиков клеточной мембраны, либо нейтрализуется с помощью систем, играющих буферную роль.

Следует отметить, что в случае резкого изменения концентрации Са2+ в цитозоле, насосы Са2+ в противовес указанному выше механизму начинают активно синтезировать АТФ.

Н+/К+ АТФ-азы играют важную роль в синтезе соляной кислоты в составе желудочного сока. В результате деятельности данных насосов, находящиеся в клетке ионы Н+ замещаются на располагающиеся вне клетки ионы К+. Это происходит на апикальной поверхности париетальных клеток, входящих в состав желез слизистого слоя желудка. Данный электронейтральный обмен является причиной поддержания постоянного уровня кислотности париетальных клеток и резкого увеличения уровня кислотности желудочного сока (РН=2,0). Н+/К+ насосы по своему строению так же состоят из α- и β- субъединиц.

АТФ-азы F -типа

АТФ-азы F -типа встречаются во внутренней оболочке митохондрий эукариотической клетки и представлены в большинстве учебников как АТФ-синтетаза. АТФ-синтетазы F-типа состоят в основном из двух частей:

1.Обращенная в сторону матрикса митохондрий гидрофильная глобулярная часть, состоящая из α- и β-субъедениц. 2.Часть, находящаяся во внутренней оболочке, осуществляющая пассивное перемещение Н+ в матрикс.

36

Рис.2.15. Схема строения фермента АТФ-синтетазы, располагающегося на внутренней мембране митохондрий [Составленно на основе информаций Т.Элстона, Г.Ванга и Дж.Остера (Nature, 1998, 391 p.510-513)].

Эти части соединены друг с другом с помощью ϒ-субъеденицы. Во время перемещения Н+ из межмембранного пространства в матрикс, ϒ-субъединица, вращаясь, подвергает конформационному изменению β-субъединицу, которая при этом синтезирует АТФ путем присоединения РО4 к АДФ (рис 2.15). Если же АТФ, связанная с α-субъеденицей, подвергается гидролизу, то Н+, находящийся в матриксе, может активно перемещаться в межмембранное пространство. Таким образом, АТФ-азы F- типа осуществляют свою работу в качестве насоса.

АТФ-азы V-типа

АТФ-азы V-типа, как следует из их названия, находятся в составе оболочки окружающей вакуолоплазму в цитоплазме. Кроме того, АТФ-азы V-типа находятся в составе плазмолеммы клеток, создающих вокруг себя кислую среду (остеокласты, макрофаги и т.д.).

Основная функция данных АТФ-аз состоит в регулировании кислотности, необходимой для протекания ферментативных процессов в соответствующих органеллах и обеспечение сочетанного перемещения Н+ с помощью энергии, создаваемой градиентом концентрации (напр. проникновение некоторыхнейромедиатороввсинаптическиепузырьки).

Несмотря на схожесть строения АТФ-аз V-типа с АТФ-азами F-типа (рис.2.15), они не способны принять участие в синтезе АТФ, а лишь являютя протонными насосами (во время гидролиза 1 молекулы АТФ в вакуолоплазму поступает 1 или 2 Н+).

АТФ-азы АВС-типа

АТФ-азы АВС-типа (АТР Binding Cassette - АТФ соединяющие кассеты) -наиболее часто встречающиеся во всех живых организмах насосы. Они отличаются как по своим функциям, так и по

37

своему строению от АТФ-аз P-, F- и V-типа. Основным отличием их строения является наличие не одного, а двух мест соединяющихся с АТФ (рис.2.16). Поэтому их называют АТФ соединяющие кассеты.

Основное функциональное отличие заключается в том, что в результате деятельности данных насосов обеспечивается перемещение из клетки, либо в некоторые органеллы не протонов, а ионов и молекул (сахара, аминокислоты, полисахариды, дипептиды, липиды, стероиды и даже некоторые белки).

Рис.2.16. Схема строения АТФ-азы АВС-типа (АТФ соединяющей кассеты).

Впервые АТФ-азы АВС-типа были обнаружены во время исследований в клетках злокачественных опухолей. Было определено, что часть данных клеток погибает под воздействием токсического действия лекарственных препаратов, в то время как другая часть клеток в тех же условиях сохраняет свою целостность и продолжает свою деятельность. После подтверждения наличия в цитоплазме клеток второй группы специфического гена, участвующего в синтезе белков АВС-типа, его стали именовать геном устойчивости к различным лекарственным средствам (MDR – multidrug resistence gene).

Внастоящее время насос, именуемый MDR-1 и синтезируемый в нормальном состоянии в малом количестве, участвует в выведении чужеродных и опасных образований из клетки. В связи с тем, что в некоторых злокачественных клетках данный насос синтезируется в больших количествах и немедленно выводит лекарственные средства, является причиной отсутствия терапевтического эффекта.

Врезультате проведенных исследований обнаружено, что белки, работающие в дыхательных путях, как каналы Cl-, обеспечивающие перемещение поступивших в цитоплазму белков-антигенов в эндоплазматическую сеть, а также участвующие в синтезе желчи печени и участвующие в создании основы хромосомы, являются АТФ-азами АВК-типа.

КАНАЛЫ

Интегральные белки, принимающие участие в процессах избирательной проницаемости путем облегченной диффузии, делятся по своим морфо-функциональным особенностям на две группы:

1.белки, образующие канал или ионные каналы (рис.2.13 - 2)

2.белки-переносчики (рис.2.13 - 3).

38

Гидрофобные аминокислоты данных белков, вращаясь в ту или иную сторону, образуют связь с цепями жирных кислот молекул фосфолипидов, а гидрофильные аминокислоты, вращаясь к центру, формируют наружную часть гидрофильного отверстия (туннель). (рис.2.13 – 2,3).

Известно, что одна часть ионных каналов, кодируемая более чем 100 генами, способна перемещать в различных направлениях клеточной мембраны лишь один ион, другая часть – несколько ионов или растворенные в воде микромолекулы.

Характерной особенностью ионных каналов является их способность к избирательной проницаемости. Данную особенность можно ясно наблюдать на примере сравнения потенциал-зависимых Na+ и К+ каналов. Известно, что ионы К+ значительно больше по своим размерам (r=0,133) в сравнении с ионами Na+ (r=0,095). Несмотря на это, скорость проведения ионов К+ через К+ канал значительно выше (как минимум в 1000 раз), чем их пропускная способность для ионов Na+. В отличие от обычных гидрофильных отверстий, ионные каналы не всегда пребывают в открытом состоянии (см. далее). В пространственном строении белков, образующих эти каналы, имеется часть, напоминающая дверь, которая лишь при воздействии определенных внутриили внеклеточных сигналов способна, изменив свою форму, привезти каналы в открытое состояние и вновь вернуться в обратную форму. (см. далее).

Учитывая сказанное выше, можно разделить ионные каналы на две группы – открытые каналы и каналы с дверью (открывающиеся/закрывающиеся).

Запирающиеся каналы (каналы «с дверью»)

Среди запирающихся каналов всесторонне изучены К+, Na+, Ca2+ и Cl--каналы.

К+ каналы. Современные представления о строении и механизмах функционирования ионных каналов, обладающих избирательной проницаемостью, наиболее полно сформировались при изучение каналов К+. Не случайно то, что автор множества инноваций в этой области Р.МакКиннон, является одним из двухученых, получившихв2003 годуНобелевскуюпремиювобластихимии.

В результате исследований проведенных Р.МакКинноном и другими авторами было определено, что каналы К+ имеют 4 субъединицы одинакового состава, которые охватывают со всех сторон путь прохождения ионов. На концах субъединиц, обращенных к поверхности клетки, имеется фильтр, обладающий избирательнойпроницаемостью, ана поверхности, обращенной всторону цитоплазмыимеется часть играющая роль двери. Роль фильтра играет гидрофильная полость, имеющая диаметр 0,2 нм и длину

сторон атомами кислорода (на рис.2.17 указ. как черные точки), входящими в состав карбонильной группы (С=О).

39

Рис. 2.17. Схема запирающего K + канала.

1- Ионный канал; 2- клеточная мембрана; 3- фильтр для ионов; 4- запирательный участок; 5- ионы К+; 6- молекулы воды

Как видно из рисунка 2.17, ионы К+ снаружи и внутри фильтра находятся лишь в соединенном с молекулой воды состоянии, а в области фильтра видны лишь дегидратированные К+. Таким образом, если в обычном состоянии К+ образует связи с атомами кислорода в составе воды, то в области фильтра подобные связи он образует с атомами кислорода карбонильной группы аминокислот. Точнее К+, теряя свою водную оболочку (после дегидратации), перемещается внутрь фильтра, вступая в связь с карбонильными группами аминокислот.

Имеется две причины значительно низкой скорости прохождения ионов Na+ по К+ каналам: 1. в связи с маленькими размерами дегидратированных ионов Na+ они не способны создавать необходимые связи с окружающими фильтр карбонильными группами; 2. по причине больших размеров ионов Na+, соединенных с молекулами воды, они не могут размещаться в полости фильтра.

У белков, образующих К+ каналы во внутриклеточной части, имеется специфический сенсорный участок со стороны цитоплазмы, способный воспринимать деполяризацию, являющийся участком соединения с Са2+ , а на части обращенной к наружной стороне клетки – участок соединения с различными лигандами. Сравнительный анализ белков во время открытого и закрытого положений канала показывает, что сенсорные участки, принимая соответствующие раздражения, оттягивают в

40

сторону α- спирали (рис.2.17 указ.стрелкой), расположенные возле цитоплазмы, тем самым приводя канал в открытое состояние.

Калиевые каналы встречаются во всех имеющихся клетках организма. Данные каналы участвуют в образовании мембранного потенциала (потенциал покоя), в регуляции осмотического давления и объема клетки, в модуляции электрических раздражений в нервных клетках и т.д.

При мутационных изменениях в синтезе белков, составляющих К+ каналы, наблюдается существенное снижение уровня ионов К+ в организме и как следствие, удлинение интервала QT на электрокардиограмме, отображающей деятельность сердца (ЭКГ). Причиной этого является запоздалое открытие калиевых каналов во время деполяризации в клетках сердечной мышцы. Тогда, в результате увеличения срока потенциала действия в сердце могут наблюдаться анормальные ритмы сердечного цикла, приводящие в итоге к внезапной смерти.

Na+ каналы по своему строению схожи с К+ каналами. Основное их отличие заключается в том, что они состоят не из отдельных субъединиц, а из одной белковой цепи с молекулярной массой 260 кД. Основной особенностью Na+ каналов является то, что они, открывшись всего лишь на одну или две миллисекунды, вновь возвращаются в закрытое состояние. Между тем первичная деполяризация, необходимая для образования потенциала действия в некоторых видах клеток, в особенности способных принимать раздражение, таких как поперечнополосатая мышечная, нервная, сердечная, возможна лишь при переходе каналов в открытое состояние.

Следует отметить, что врожденная недостаточность синтеза белков натриевых каналов также может являться причиной удлинения интервала QT на ЭКГ. Однако в данном случае появление анормальных ритмов наблюдается в результате запоздалой реполяризации из-за удлинения периода возвращения Na+ канала в неактивное состояние. Местные анестетики (лидокаин, прокаин), которые используются при обычных медицинских операциях, сохраняя каналы Na+ в закрытом состоянии, препятствуют возникновению потенциала действия и тем самым нарушают транспорт болевого импульса в центральную нервную систему.

Са2+ каналы в сравнении с другими катионовыми каналами представлены сложными белковыми комплексами, которые состоят из субъединиц (α, α2, β, ϒ) различного состава и количества. Данные каналы находятся как в клеточной оболочке, так и в оболочке окружающей эндоплазматическую сеть.

Са2+ канал, активирующийся во время деполяризации клеточной мембраны и присоединения лиганда к определенной рецепторной части, обеспечивает перемещение ионов Са2+ в цитоплазму по градиенту концентрации.

Са2+ каналы играют важную роль в регулировании мембранного потенциала, в сокращении мышц, в процессе секреции, в образовании межклеточных связей, в осуществлении в качестве вторичного посредника, различных процессов, идущих в клетке.

Cl- каналы. Это самые распространенные потенциал-зависимые каналы. До настоящего времени среди них обнаружено более 15-ти изомеров. Белки, участвующие в их образовании, состоят из двух субъединиц (димеры).