Цитология (Э.К.Гасымов)

51

вступают в связь с опсониновыми рецепторами на поверхности фагоцитов, запуская при этом процесс фагоцитоза. Возникновение связи опсонина с рецептором также называют слипающейся стадией фагоцитоза. После этого начинается процесс поглощения чужеродных частиц. Для этого, выросты на поверхности клетки (псевдоподии) соединяются между собой, охватывая частицу со всех сторон (рис.2.27 А). В итоге частица, окруженная клеточной оболочкой, поступает в клетку в качестве фагосомы. После соединения фагосомы с первичной лизосомой в цитоплазме начинается процесс уничтожения и переваривания чужеродных частиц.

Макропиноцитоз

Термин макропиноцитоз используется для обозначения процесса поступления пузырьков (макропиносомы) (2.26 - 8) с большим объемом жидкости в цитоплазму клетки (пузырьки достигают 1мкм), образованных в результате соединения ламеллоподий (рис.2.27 В), являющихся выростами клеточной оболочки. Примером макропиноцитоза может служить процесс поглощения тиреоглобулина Т-тироцитами щитовидной железы или процесс поглощения большого объема жидкости дендритическими клетками для обеспечения иммунного контроля. Следует отметить, что под воздействием факторов роста, процесс макропиноцитоза может временно протекать и в других клетках.

Микропиноцитоз

Микропиноцитоз в свою очередь имеет несколько форм:

1.Простой (без покрытия) пиноцитоз – поперечный размер пузырьков до 100 нм. (рис.2.26 - 6)

2.Пиноцитоз с клатриновым покрытием (рецептор-опосредованный) – поперечный размер пузырьков колеблется в пределах 100-150 нм (рис.2.26 -7).

3.Кавеолы – поперечный размер пузырьков 50-80 нм (рис.2.26 - 5)

Лишь в одном из вышеуказанных форм пиноцитоза – рецепторопосредованном, пиноцитозные пузырьки окружены клатриновым покрытием, образованным несколькими белками. В связи с этим, фагоцитоз, простой пиноцитоз, кавеолы называют также эндоцитозом без клатринового покрытия.

Простой пиноцитоз (без покрытия)

Относительно механизма образования пузырьков в процессе простого пиноцитоза (рис.2.27 С), а также об их дальнейшей судьбе нет какого-либо общепринятого суждения. Наряду с этим, в виду отсутствия у них белка кавеолина и клатринового покрытия, имеется не малое количество информации о принятии их за самостоятельную производную и об их роли в обеспечении транспорта между клеточной мембраной и органеллами, в частности между лизосомами и комплексом Гольджи. Экспериментально было доказано, что перемещение некоторых молекул (İL-2, липиды, бактерии, токсины и т.д.) обеспечивается пузырьками, не имеющими покрытия.

52

53

Рис. 2.27. Электронно-микроскопический снимок форм эндоцитоза.

А. Фагоцитоз – поглощение подвергшегося деструкции миелинового нервного волокна со стороны эндоневрального макрофага;

В. Макропиноцитоз – поглощение большого объема воды и растворенных в воде веществ из просвета сосуда в клетку при помощи отростков эндотелиальных клеток артериальных сосудов;

С. Рецептор-опосредованный эндоцитоз (показан одной стрелкой) и простой пиноцитоз (показан двумя стрелками);

D. Видны кавеолы связанные и не связанные с клеточной мембраной периневральных клеток. 1. эндоневральный макрофаг; 1.деструктивное безмиелиновое нервное волокно;

3.эндотелиальная клетка; 4.отростки эндотелиальной клетки; 5.поглощаемая жидкость; 6.клеточная мембрана; 7.рецептосома; 8.пиносома; 9.периневральная клетка; 10.кавеола-связанная с клеточной мебраной; 11.кавеола-не связанная с клеточной мембраной.

Кавеолы

Кавеолы, будучи пузырьками (рис.2.26-5, 2.27 D), соединенными с клеточной мембраной посредством узкого перешейка, встречаются практически во всех формах клеток, в частности в клетках эндотелия. Обнаружение в стенках кавеол молекул, участвующих в образовании «плота» (см. выше), указывает на тесную связь между этими двумя образованиями. Точнее предполагается, что кавеолы образуются именно в области данных плотов. В образовании кавеол принимают участие элементы, составляющие «плот», а так же белок кавеолин, имеющий связи с холестерином и жирными кислотами, который играет особо важную роль. В связи с наличием в области кавеол множества рецепторов, сигнальных молекул и переносчиков, они играют роль сигнального центра, дающего старт многим процессам, протекающих в клетке. Нахождение в области перешейка и вокруг него белка динамина (см.далее) имеющего ГТФ-азную активность, который участвует в отделении пузырька от цитоплазмы, свидетельствует о способности пузырька поступать в цитоплазму в качестве самостоятельного транспортного пузырька.

Кавеолы также способны перемещать в цитоплазму некоторые небольшие молекулы, не теряя при этом связь с клеточной оболочкой. Во время этого процесса, именуемого патоцитозом, некоторые небольшие молекулы (напр. холестерин), поступают в цитоплазму методом диффузии, вступая при этом в связь лишь со стенкой кавеолы.

Рецептор-опосредованный эндоцитоз – пиноцитоз с клатриновым покрытием

С помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза обеспечивается поступление в клетку различных веществ – лигандов (напр. трансферринов, липопротеинов, токсинов, иммуноглобулинов, факторов роста, некот.вирусов) (рис.2.26 -7). Основной причиной того, что данный процесс носит избирательный характер является наличие в мембране клеток интегральных белков, играющих роль рецептора, способных соединяться лишь с определенными лигандами. После установления участия белка-клатрина в образовании пузырька, было установлено участие в данном процессе, еще более чем 25-ти белков. Не останавливаясь на подробном описании каждого из них отметим, что в образовании пузырька с покрытием, роль рецептора в основном играют интегральные белки, адапторные (арестин, АР-2) белки (сортировщики), клатрин, динамин и амфифизин. (рис.2.28).

54

Рис.2.28. Схематический рисунок механизма образования пиноцитозного пузырька с клатриновым покрытием.

1- внеклеточная среда; 2- клеточная мембрана; 3- цитоплазма; 4- лиганд; 5- рецептор; 6- АР-2; 7- клатрин; 8- динамин; 9- амфифизин; 10пузырек с клатриновым покрытием; 11пузырек освобожденный от клатрина.

Было выявлено четыре вида белков, играющих роль адаптера (Adapter proteins AP1, АР2, АР3, АР4). Среди них в процессе эндоцитоза участвует лишь АР2. Адаптерные белки играют роль моста между клатрином и цитоплазматической поверхностью интегрального белка (рецептора). Процесс образования белком АР2 связи между цитоплазматической поверхностью интегрального белка и клатрином указывает на начало процесса рецептор-опосредованного эндоцитоза. (рис.2.28).

Белок клатрин состоит из трех тяжелых (190кД) и трех легких (30кД) цепей. Тяжелые и легкие цепи, соединяясь, отходят от центральной точки в виде трех лучей, образуя структуру именуемую

трискелионом (рис.2.28).

Как только АР2 соединяется с комплексом лиганд-рецептор (рис.2.26-6, 2.28), они так же связываются и с молекулами клатрина и образуют окантованную ямку (рис.2.29) на поверхности клеточной мембраны. Молекула АР2 и клатрина соединяясь между собой вокруг ямки, образуют плетеную сеть, имеющую пять или шесть отверстий. Параллельно с образованием сети, трискелионовый комплекс меняет свое пространственное строение, углубляя ямку и превращая ее в пузырек (рис.2.29 -2,3).

55

Рис.2.29. Этапы формирования пузырька с клатриновым покрытием. 1 - образование инвагинации с покрытием;

2– углубление инвагинациии с покрытием;

3– отшнуровка пузырька с покрытием;

4– погружение рецептосомы в цитоплазму ( B.M.M. Perry. J.Ctll Sciens,19979, v.39, p.266)

По мере углубления пузырьков в цитоплазму амфифизин, располагающийся в области перешейка, образует связи, с одной стороны с клатрином и АР2, а с другой стороны с белком динамин (рис.2.28), имеющим ГТФ-азную активность. Белки динамина, соединяясь друг с другом, образуют кольцо в области перешейка пузырька (рис.2.28). Подвергшийся гидролизу белок динамина, изменив свою конформацию, способствует сужению области перешейка пузырька с последующим его отделением от клеточной мембраны. Т.о., окруженный со всех сторон клатрином и АР2 белком пузырек, имеющий в своей полости часть мембраны, поступает в цитоплазму (рис.2.28,2.29 -4).

56

Как только данный пузырек поступает в цитоплазму, он теряет свой клатрин и АР2 покрытие под воздействием специфических факторов HSP70 (белки теплового шока), шапероны (рис.2.28) и соединяется с первичной эндосомой. (см.ниже).

Исследования последних лет показали, что в образовании и поступлении в цитоплазму клатринового пузырька участвуют элементы цитоскелета – актин и связанные с ним белки. (M.SekiyaKaüasaki et al, 2003, E.Smythe and K.R. Ayscohdh, 2003).

Подводя итоги изучения сведений, связанных с процессом эндоцитоза, следует отметить, что эндоцитоз с клатриновым покрытием происходит на тех участках плазмолеммы, где сосредоточены лиганд-рецепторные комплексы, а эндоцитоз без клатринового покрытия (простой эндоцитоз, кавеолы, макропиноцитоз, фагоцитоз) происходит с участием специализированных участков клеточной мембраны, называемой «плотом». В образовании эндоцитоза без клатринового покрытия в определенной последовательности принимают участие белки - кавеолин, ARF (белок связанный с ГТФ, отделяющий пузырьки от транс-сети комплекса Гольджи), динамин, анкирин, спектрин, и актин.

Экзоцитоз

Дословно термин экзоцитоз обозначает процесс выведения из клетки, посредством клеточной мембраны веществ, синтезируемых в клетке, либо ненужных производных, образованных в результате процессов метаболизма и зачастую может заменяться термином секреция (выделение). Однако следует учесть, что во время секреции, наряду с выведением синтезируемых веществ, обеспечивается также обновление состава самой клеточной мембраны.

Впроцессе экзоцитоза существует два вида связей между клеточной оболочкой и мембраной пузырька с остаточными частицами,: 1) полное слияние и 2) механизм «поцеловал и убежал» (kiss and run), без полного слияния, с частичным освобождением.

Впроцессе полного слияния клеточная оболочка, окружающая пузырек, целиком сливается с клеточной мембраной, при этом полностью высвобождает секрет, находящийся в ее полости в околоклеточное пространство и вновь возвращается в цитоплазму при помощи клатринового покрытия.

Впроцессе механизма «поцеловал и убежал» в месте соединения оболочки пузырька с клеточной мембраной посредством определенных молекул образуется небольшое отверстие (рис.2.30). Это отверстие, достигая определенных размеров, высвобождает секрет за 6 миллисекунд и тут же восстанавливает свою целостность (рис.2.30).

Если этого времени (6 миллисекунд) оказывается достаточным для высвобождения нейромедиатора из синаптического пузырька нервной системы, то эпителиальные клетки за данный промежуток времени могут высвободить лишь малую часть гранул секрета с плотным содержимым. Т.о., в процессе механизма «поцеловал и убежал», с одной стороны отпадает необходимость возврата оболочки пузырька обратно в цитоплазму, с другой стороны становится возможным регулировать количество (кванты) высвобождаемого секрета.

57

Рис.2.30. Виды экзоцитоза: “kiss and run” и абсолютное слияние. Схема.

1- Клеточная мембрана; 2- экзосома; 3- формирование поры слияния; 4- расширение поры слияния (высвобождение содержимого); 5- восстановление целостности мембран (kiss and run); 6- абсолютное слияние; 7- комплекс SNARE; 8- динамин; 9- клатрин.

Для объяснения связи оболочки секреторного пузырька с клеточной оболочкой в процессе экзоцитоза, со стороны Дж. Ротмана и его сотрудников, была выдвинута гипотеза SNARE.

Термин SNARE является абравиатурой, которая в свою очередь состоит из трех терминов: N-ethylmaleimide-sensitive fusion factor (NSF) – чувствительный к N-этилмалеимиду фактор слияния.

Это название было дано потому, что NSF, под воздействием N- этилмалеимида теряет свою активность и останавливает движение пузырьков в клетке.

Soluble NSF attachment proteins (SNAPs) – это белки соединяющиеся с жидким NSF. Жидкий NSF

может поддерживать связь с оболочками лишь совместно с особой группой белков. SNAP reseptors (SNARES) - рецепторы SNAP.

Как видно из термина SNARE в процессе экзоцитоза участвуют NSF, соединенные с ним белки (SNAPs)

иих рецепторы.

Ввиду того, что один из рецепторов SNAР располагается в стенке пузырька, его называют также v-SNARE (рис.2.31-1) или VAMP (vesicle assosiated membrane protein) – мембранный белок связанный с пузырьком, либо синаптобревин.

А рецептор SNAР, располагающийся в мембране в области прикрепления пузырька, называется t-SNARE (рис.2.31-1) или синтаксин. Буква t является начальной буквой английского слова target (мишень) и указывает на то, что в процессе экзоцитоза клеточная мембрана является мишенью.

Умлекопитающих было выявлено более 35-ти видов белков SNAP и белков соответствующих им рецепторов. В процессе экзоцитоза участвуют лишь белок VAMP (v-SNARE)/

SNAP-25 и синтаксин (t-SNARE) (рис.2.31).

58

Рис.2.31. Последовательность образования комплексов транс- и цисSNARE во время экзоцитоза. Описание в тесте. Схема составлена на основании информации J.B. Bock and R.H. Scheller, 1999; T. Weber et al, 2000; X.Hna and R.H. Scheller, 2001; J. Melia et al, 2002 (см.список литертуры).

Как видно из рисунка 2.31 -1, c секреторным пузырьком соединяется лишь v-SNARE (зеленого цвета), а белки t-SNARE (синие) и SNAP-25 (красные) расположенны на стороне клеточной мембраны. Отличие t-SNARE от SNAP-25 заключается в наличии регуляторного участка в его NH2 конце (фиолетового цвета).

А белок SNAP-25 имеет участки для соединения как с t-SNARE так и с v-SNARE. Первоначально по гипотезе SNARE процесса экзоцитоза предполагалось, что приближения

синаптического пузырька к клеточной мембране и их слияние, осуществляется благодаря перекручиванию вышеуказанных белков друг с другом (рис.2.30). Но последующие исследования показали что, во время возникновения комплекса SNARE, завитки α-спиралей белков не только не перекручиваются друг с другом, а напротив, располагаются параллельно и сжимаются. Эти исследования, демонстрирующие очень тесное расположение полностью спирализированных частей белка, позволили Р.Линну и Р.Шеллеру (1997) выдвинуть теорию “zippering” (молния) для обьяснения

59

процесса возникновения комплекса SNARE. В данный момент эта теория принята со стороны многих исследователей.

Возникновение комплекса SNARE во время экзоцитоза является энергозависимым процессом и происходит при помощи энергии образованной при распаде АТФ с участием NSF АТФ-азы и α-SNAР, который является его коферментом.

Вэто время, последовательно происходят следующие процессы:

-периферическая часть v-SNARE связывается с белком SNAP-25 (рис.2.31-2);

-регуляторная часть, расположенная на NH2 конце t-SNARE, отдаляется от места образования комплекса SNARE (рис.2.31-3);

-Белки t-SNARE и SNAP-25 вследствие уплотнения их спиралей приближаются к клеточной оболочке

(рис.2.31-4);

-в результате сохранения плотного расположения спиралей v-SNARE из 4х присоединенных друг к

SNARE в составе клеточной мембраны). В этот момент оболочка, окружающая секреторный пузырек, приближается к оболочке клеточной мембраны до момента соприкосновения (рис.2.31-5). Следует отметить, что комплекс транс-SNARE устойчив, как к ферментам (напр. NSF АТФ-аза), так и к физическим факторам (напр. к температуре до +970. За время существования этого комплекса, биологически активные вещества в составе синаптического пузырька могут частично высвободиться из цитоплазмы (рис. 2.30):

- завершающим итогом становится поступление ионов Са2+ в цитозоль, что становится причиной полной спирализации комплекса SNARE и оболочка синаптического пузырька соединяется с оболочкой клеточной мембраны, в результате чего секрет полости пузырька полностью высвобождается из клетки

(рис. 2.31-6).

Ввиду того, что белки в составе комплекса SNARE располагаются в этот момент с одной стороны мембраны (на поверхности обращенной к цитоплазме) их называют комплекс цис-SNARE. Вследствие того, что комплекс цис-SNARE расщепляется под воздействием NSF АТФ-азы, составляющие его части возвращаются в свое исходное положение для того, чтоб вновь принять участие в процессе экзоцитоза

(рис.2.31-1).

Принятие раздражений (рецепторная функция)

Одним из важных свойств каждой клетки является ее способность выбирать из всевозможных воздействующих факторов (сигналов) окружающей среды (раздражители, лиганды) лишь те, которые являются необходимыми для ее жизнедеятельности и обеспечивать им соответствующий ответ.

К воздействующим факторам можно отнести химические вещества (газы, аминокислоты, белки, нуклеотиды, стероиды и липидные образования), физические факторы (различные облучения, механическое воздействие, осмотическое давление), другие клетки и межклеточные образования.

В основе ответа каждой клетки на определенные воздействия лежит наличие особых рецепторов на ее поверхности или в цитоплазме, связывающихся с соответствующими факторами и веществами (лиганды), несущими информацию. Связь лиганда с рецептором носит непременноизбирательный характер и требует соответствия, подобно соответствию замка к ключу. Т.е., лишь в случае соединения

60

лиганда с соответствующим ему рецептором, возможен запуск определенных ответных реакций. Одним из свойств лиганда является его способность воздействовать и при низких концентрациях.

Можно сказать, что все процессы, протекающие в клетке (рост, секреция, движение, метаболизм, пролиферация, регенерация, дифференциация и т.д.), происходят благодаря многочисленному количеству сложных реакций, образующихся после соединения сигнальных молекул с соответствующими рецепторами.

Взависимости от физико-химических свойств лиганда, рецепторы могут располагаться, либо на мембране клетки, либо в ее цитоплазме. Если воздействующие факторы способны преодолеть фосфолипидный слой, то их рецепторы располагаются в цитоплазме и именуются ядерными рецепторами. К таким лигандам можно отнести различные излучения, стероидные гормоны (половые, минералокортикостероиды, гликокортикостероиды), гормоны щитовидной железы, ретиноиды, витамин Д, азот-2-оксид (NO) и карбон-2-оксид (СО).

Всвязи с неспособностью большинства лигандов растворяться в воде, их рецепторы расположены на клеточной мембране.

Все рецепторы являются белками, а точнее гликопротеинами, независимо от их расположения, механизма работы и формы.