Цитология (Э.К.Гасымов)

41

Рис.2.18. Образование ионного фильтра в центре Cl- канала, путем охватывания его положительно заряженными аминокислотными остатками в антипараллельно расположенных α-спиралях субъединиц канала.

В отличии от К+ каналов в Cl- каналах путь для ионов находится не между субъединицами, а внутри каждой из них. В связи с этим их сравнивают с двуствольным ружьем. Это свойство делает Cl- каналы схожими с поринами и аквапоринами.

Второй отличительной особенностью Cl- каналов по сравнению с К+ каналами, является то, что часть, играющая роль фильтра, находится не вблизи от поверхности клетки, а в центре канала.

Каждая субъединица Cl- каналов состоит из 18 α- спиралей и имеет две схожие части. При этом аналогичные друг другу части, распологаются в противоположных направлениях (антипараллельно) (рис.2.18), охватывая ионный канал со всех сторон. Таким образом, части субъединиц, несущие положительный заряд (окрашены на рисунке 2.18 красным), развернувшись в сторону центра клеточной мембраны, со всех сторон охватывают отверстие, играющее роль фильтра, длина которого 1,5нм, а ширина 0,2нм. Выше и ниже данного отверстия расположены гидратированные ионы Cl- (рис.2.19) . Способность, описанного выше канала избирательно пропускать только ионы Cl- объясняется наличием в области фильтра специальных участков, способных соединяться с ионами Cl-. В обычном состоянии эти места заняты карбоксильными группами глютаминовой кислоты.

Рис.2.19. Ионы Cl- соединяются с областью фильтра после отсоединения молекул воды. После перемещения они вновь соединяются с молекулами воды и переходят с одной стороны канала в другую

(Farhle C. Am. J. Physiol. Ren. at Physiol. 2001, v.280,F 748 – F 757).

42

Вследствие различных физических и химических воздействий (электрический потенциал, концентрация Cl- и pH) указанные карбоксильные группы меняют свое положение и их места занимают ионы Cl-. Наличие положительно заряженных частей в области фильтра притягивает ионы Cl-, тем самым обеспечивается их прохождение с одной стороны клеточной мембраны в другую (рис.2.19).

Cl- каналы участвуют в усилении чувствительности клеточной оболочки к раздражению (в частности в поперечнополосатых мышечных волокнах и нервных клетках), в регулировании внутриклеточного давления, в регулировании уровня pH в составе органелл, а также в прохождении солесодержащих молекул и воды сквозь эпителиальные выстилки.

Вслучае мутационных изменений Cl- каналов наблюдается болезнь Томпсона (миотония) и мочекаменная болезнь.

Взависимости от того, какие физические и химические факторы, влияют на открытие ионных каналов, можно выделить механо-чувствительные, потенциал-зависимые, G-белок-зависимые, лигандзависимые (медиатор-зависимые, нуклеотид-зависимые, АТФ-зависимые, пептид-зависимые) каналы.

Механо-чувствительные каналы.

Открытое состояние данных каналов возможно только в результате физического воздействия на клетку. Примером могут послужить волосковые клетки в органе слуха и механорецепторы тельца Фатера-Пачини. Так было выявлено, что расположенные на фаланговых клетках базилярной пластинки сенсорные волосковые клетки перепончатой улитки на своей апикальной поверхности имеют особые микроворсинки - стериоцилии. Последние могут вступать в тесный контакт с белками покровной (текториальной) мембраны кортиева органа с помощью особых тонофибрилл. Поэтому в такт полученным акустическим сигналам происходит резонансные отклонения стереоцилий в определенном направлении, что вызывает натяжения вышеназванных тонофибрилл. Это приводит к открытию канала. При этом большое количество ионов (в основном катионов) проникают в цитоплазму, что вызывает деполяризацию волосковых сенсорных клеток, а это в свою очередь передается нервным клеткам. В итоге данные воздействия, обернувшиеся нервным импульсом, воспринимаются мозгом в виде звука (интерпретация).

Потенциал-зависимые каналы открываются и закрываются в результате изменения потенциала вокруг плазмолеммы клетки. К примеру, при проведении импульса нервным волокном деполяризация

определенной части данного волокна не позволяет закрывшимся на небольшой период времени (несколько миллисекунд) Na+ каналам аксолеммы открыться вновь. Это имеет особое значение для передачи каждого нервного импульса в отдельности и носит название рефракторного периода.

G-белок-зависимые каналы. Конформационные изменения белков, составляющих данный

канал и приводящие к его открытию либо закрытию, возможны лишь при участии G-белка. Примером может служить открытие К+ каналов, во время присоединения G-белка к рецептору ацетилхолинмускорина в сердечной мышце.

Лиганд-зависимые каналы. В белках, образующих данный канал, имеется рецепторная часть, соединяющаяся с сигнальными молекулами (лигандами). Поэтому, открытие их возможно лишь во время соединения лиганда с рецептором. Данные каналы в отличие от потенциал-зависимых каналов, снова закрываются лишь после отсоединения лиганда. Для активации данных каналов в роли лиганда выступают нейромедиаторы, некоторые нуклеотиды, АТФ, ГТФ и небольшие пептиды:

- медиатор-зависимые каналы расположены в основном в постсинаптической оболочке синаптической области и соединяясь с соответственным нейромедиатором изменяют свою конфигурацию, тем самым обеспечивая поступление определенных ионов в клетку. Если поступивший

43

в цитоплазму ион является положительным, то в результате деполяризации импульс передается от одной клетки в другую. Если поступит отрицательный ион, то вследствии гиперполяризации импульс от клетки к клетке не передаётся. Поэтому первая группа носит название раздражающих, а вторая группа -

тормозящих медиаторов.

-нуклеотид-зависимые каналы изменяют свою конформацию во время соединения с циклическим аденозинмонофосфатом (цАМФ), либо с циклическим гуанозинмонофосфатом (цГМФ), пропуская при этом соответствующие ионы в клетку. Примером этому может служить открытие соответствующих ионных каналов во время присоединения цГМФ к палочковым клеткам сетчатой оболочки и цАМФ к обонятельным рецепторам.

-АТФ-зависимые каналы- участвуют в поступлении катионов в клетку во время присоединения АТФ, находящейся вне клетки. Молекулы АТФ в синаптическом пузырьке находятся в связанном с нейромедитором состоянии и выводятся при помощи экзоцитоза. Примером могут служить симпатические нервы, иннервирующие сосуды, и нервы участвующие в восприятии боли. Следует отметить, что наряду с АТФ-зависимыми существуют также ГТФ-зависимые каналы. Вместе их

называют «пуринергическими» каналами и обозначают соответственно P2X и P2Y.

- пептид-зависимые каналы. Данные каналы, открывающиеся при воздействии мелких пептидов, впервые были обнаружены у беспозвоночных. Они избирательно участвуют в перемещении лишь ионов Na+.

Несмотря на установленные фактические данные, подтверждающие синтез определенных пептидов в человеческом мозге, информация об их функции все еще является поверхностной.

Открытые ионные каналы

Наряду с указанными выше запирательными каналами существуют также и постоянно открытые каналы. Среди них наиболее часто встречающимися являются К+ каналы, водные каналы – порины и аквапорины.

Следует отметить, что наряду с потенциал-зависимыми и лиганд-зависимыми К+ каналами, во всех клетках человеческого организма существуют так же открытые каналы К+. Эти каналы также называют выпрямляющими К+ каналами. Они регулируют потенциал покоя, способность нервных клеток и клеток сердечной мышцы к раздражению.

44

Рис.2.20. Схематический вид сагитального разреза субъединицы AQP1. Показано перемещение молекул воды из внеклеточного пространства в цитоплазму. Видны 4 молекулы воды, расположенные в ряд в центре канала. Дополнительная информация дана в тексте (P.Aqre,D.Kozono. – FEBS Letters 27718,2003,p.1-7).

Водные каналы - аквапорины. Несмотря на то, что аквапорины относятся к семейству самых древних белков, определяющихся в живых организмах (от бактерий до человека) их роль в качестве канала для молекулы воды была выявлена сравнительно недавно.

В 1988-м году П.Агре с сотрудниками опубликовали информацию о выделенном ими из эритроцитов и эпителиоцитов почечных канальцев ранее неизвестного белка СНİP28. В ходе дальнейших углубленных исследований после выявления состава белка и гена, участвующего в его синтезе, авторы добиваются экспресcии данного белка на оболочке яйцеклетки шпорцевой лягушки (Xenopus). Яйцеклетка, слабо проводящая воду в обычном состоянии, после экспрессии данного белка в гипотонических (гипоосмотических) растворах набухает и лопается. С того момента было подтверждено, что обнаруженный белок CHİP28, является водным каналом и в

данное время он именуется аквапорин-1 (AQP1).

Каждый из водных каналов состоит из четырех субъединиц, которые в свою очередь состоят из 6 внутримембранных α- субъединиц. В центре каждой субъединицы имеется похожий на песочные часы канал, в котором размещаются молекулы воды (рис.2.20). Со стороны обращенной к цитоплазме и к поверхности клетки диаметр данного канала составляет 2 нм, в направлении же к центру канал (коридор) сужается.

Выше от центра канала на расстоянии 0,8 нм, имеется узкое отверстие диаметром 0,28 нм (примерно равное диаметру молекулы воды). Вокруг отверстия и в области сужения канала расположены положительно заряженные аминокислоты (рис.2.20 R195, H180). Данные каналы проводят только молекулы воды и на это есть три причины:

1.Каналы являются узкими

2.Электростатическое проталкивание катионов положительно-заряженными аминокислотами, расположенными вокруг отверстия

3.Аминокислоты располагаются в центре канала не близко друг к другу и несут положительный

заряд на противоположных полюсах (рис.2.20 N76).

Таким образом, обеспечивается прохождение молекул воды, сквозь канал не обычным током, а путем вращения. Это препятствует прохождению протонов в центре канала способом разбрызгивания

(“proton hopping”).

В 2003 году П.Агре стал лауреатом Нобелевской премии благодаря своим заслугам по обнаружению участвующего в образовании водного канала AQP1, а также благодаря исследованиям по пространственному строению и механизму работы данного канала. В результате интенсивных работ последних лет, наряду со сбором информации о строении аквапоринов, была также выяснена их роль в образовании ряда заболеваний. Примечательным фактом является то, что в результате исследований, проведенных с аквапоринами, были подтверждены принципы возникновения дисфункций белка на молекулярном и атомарном уровнях.

AQP1 чаще всего встречаются в эритроцитах, в эндотелиальных клетках сосудов, в проксимальных извитых канальцах почек и в желудочках мозга (в местах образования спинномозговой жидкости). При врожденных нарушениях синтеза AQP1 на фоне отсутствия видимых изменений, у

45

данных лиц уровень концентрации выделяемой ими мочи не превышает 450 мОсм (в норме 1000-12000 мОсм) и выявляется недостаточное количество воды в секрете потовых и других желез.

В случае недостаточности AQP2 происходит нарушение реабсорбции воды собирательными почечными канальцами, в результате чего выделяется до 20 литров мочи в день (в норме 1,5-2,0л), что приводит к возникновению нефрогенного несахарного диабета.

В настоящее время обнаружено 10 изомеров аквапорина у млекопитающих. 4 из них (AQP1, AQP2, AQP4, AQP5) обеспечивают прохождение сквозь клеточную мембрану в обоих направления только молекул воды, 4 других (AQP3, AQP7, AQP9, AQP10) - проводят кроме воды также и молекулы глицерина. Оставшиеся два аквапорина (AQP6, AQP8) участвуют соответственно в образовании межклеточных связей и регуляции РН в составе органелл. Следует отметить, что скорость проникновения молекул воды сквозь клеточную мембрану посредством простой диффузии очень мала. Благодаря присутствию аквапоринов, в результате изменений, происходящих по различным причинам вокруг клеточной мембраны, становится возможным проникновение 106 молекул воды сквозь клеточную оболочку в обоих направлениях. Мгновенное набухание эритроцитов (в гипотоническом растворе) либо их сморщивание (в гипертоническом растворе), зависящее от осмотического давления окружающей среды связано с наличием молекулы аквапорина-1 в их стенке.

Порины - являются белками, образующими открытый, наполненный водой канал и более широкие по сравнению с другими каналами. Они обнаруживаются в наружной оболочке митохондрий, хлоропластов и грамотрицательных бактериях. Состоят они не из внутримембранных α- спиралей, а из β- складок.

Рис. 2.21. Строение мономера порина. Имеется от 16 до 18 складок в составе каждого мономера.. (H.Nikaido. J.Microb, and Mol.Biol. Ref.,2003,v.67,4,p.593-656).

Порин-триммер, состоящий из трех субъединиц. 16-18 β - складок каждой из трех субъединиц, напоминают форму бочки и располагаясь параллельно друг другу, но в противоположных направлениях, окружают канал со всех сторон (рис.2.21).

Наряду с ионами через пориновые каналы могут свободно проходить, также и низкомолекулярные гидрофильные молекулы.

46

Белки – переносчики

Данные белки так же называют ионофорами или транспортерами. Молекулы белковпереносчиков неоднократно перекрещиваются с клеточной мембраной и с одной либо с обеих сторон имеют участки для соединения с определенными ионами и молекулами. Поэтому, по сравнению с белками, образующими ионные каналы белки-переносчики лишь после непосредственного соединения с ионами и молекулами обратимо изменяют свою конформацию, и обеспечивают перенос с одной стороны мембраны на другую (рис.2.14).

Перенос обеспечиваемый белками-переносчиками, может быть как одиночным, так и сочетанным, т.е. подразделяется на две группы (рис.2.22).

Во время одиночного переноса (унипорт) лишь одно вещество способно перемещаться в одном направлении (рис.2.22 -1). Во время сочетанного перемещения, белок-переносчик способен обеспечить перенос двух и более веществ (рис.2.22 -2) в одном (симпорт) и противоположных (антипорт) направлениях (рис.2.22-3).

Рис.2.22. Виды одиночного и сочетанного перемещения.

1- унипортный транспорт; 2- симпортный совместный транспорт; 3- антипортный совместный транспорт; 4- аминокислота; 5- глюкоза; 6- Na+; 7- АДФ; 8- АТФ.

Одиночное перемещение (унипорт)

Одиночное и сочетанное перемещение ионов и молекул показано в таблице 2.2 Как видно из таблицы белки, участвующие в одиночном перемещении (унипорт) глюкозы и

аминокислот, осуществляют его при помощи облегченной диффузии (рис.2.22-1).

47

У белков, обеспечивающих унипорт, либо на внутриклеточной их части, либо на поверхности, обращенной к цитоплазме, имеются участки для соединения с глюкозой (рис. 2.23) и аминокислотами. Как только происходит соответствующее соединение белки, подвергшись конформационному изменению, перемещают глюкозу и аминокислоты по градиенту концентрации (рис.2.23 В и С). Таким образом, глюкоза перемещается из плазмы крови в эритроциты, а в клетках печени, напротив (в участках синтеза глюкозы) из цитоплазмы в межклеточную жидкость.

Как видно из таблицы, сочетанное перемещение в одном (симпорт) направлении ионов и молекул осуществляется с помощью энергии, образованной вследствии разности концентрации ионов Na+ (см.стр.28), т. е. с помощью вторичного активного транспорта. Еще одна особенность белков, осуществляющих симпорт-перемещение, заключается в том, что на их поверхности, обращенной к цитоплазме или внутрь клеток, есть участки для соединения не только с молекулами Na+, но и с другими ионами и молекулами (рис.2.24). Сочетанное перемещение глюкозы и Na+ в одном направлении, осуществляется с помощью гликопротеинов кодируемых SGLT генами. Они располагаются на апикальной поверхности эпителия проксимальных извитых канальцев почек и энтероцитов тонкой кишки и обеспечивают поступление глюкозы в цитоплазму соответствующих клеток.

Рис.2.23. Облегченная диффузия при помощи переносчика.

С помощью переносчика Na+/Cl-, Na+/K+/2Cl- обеспечивается проницаемость эпителиальных тканей и регуляция процессов секреции. В реабсорбции фосфатов проксимальными канальцами почек участвуют Na+/ H2PO4- -переносчики, кодируемые NТР2 генами.

Белки, участвующие в противоположно направленном (анти-порт) транспорте ионов, именуются также катионными (Na+/H+, Na+/Ca2+) и анионными (Cl-/HCO3-) обменниками. С помощью деятельности Na+/H+ катионного обменника в почках, в пищеварительной трубке и во многих других органах, в результате поступления Na+ в цитозоль и выведения оттуда H+, образовавшего в процессе метаболизма, обеспечивается регуляция уровня pН.

Na+/Са2+ катионные обменники встречаются во многих клетках, в частности в тех, которые способны раздражаться и сокращаться. В результате деятельности этого белка 3 Na+ поступают в клетку, а один Са2+ покидает ее против градиента концентрации. Благодаря работе Na+/Са2+ переносчика и Са2+ насоса, разность концентрации Са2+ в клетке и вне ее достигает 10 тысяч.

48

К переносчикам, осуществляющим противоположное сочетанное перемещение (антипорт) относятся так же АДФ/АТФ-переносчики, расположенные во внутренней оболочке митохондрий.

Субъединицы (2 шт.), в составе данных переносчиков, состоящие из 6 α-спиралей, предположительно считаются предками остальных переносчиков.

В результате деятельности АДФ/АТФ-переносчиков, АДФ находящаяся в цитоплазме замещается на АТФ, синтезирующийся в матриксе митохондрий (рис.2.22).

Рис.2.24. Вторичная активная проницаемость. Перенос глюкозы против градиента концентрации с помощью энергии, образованной разностью концентрации ионов (Na+) благодаря работе Na+/K+ насосов.

Среди анионных обменников широко изученным является расположенный в плазмолемме эритроцитов белок-полоса 3. Углекислый газ (СО2), образующийся в тканях при окислительных процессах, поступив в цитоплазму эритроцитов преобразуется в анион бикарбоната (НСО3-) под воздействием фермента карбоангидразы.

Следует отметить, что белки, составляющие данные структуры, функционируют не поодиночке, а все вместе, координируя свою деятельность, тем самым обеспечивая присущие каждой клетке функции, регулируя объем клетки, приспосабливая ее к окружающей среде и т.д.

Примером этому может служить перемещение ионов Na+ и Сl- из толстого отдела восходящей петли Генле входящего в состав морфо-функциональной единицы почки (нефрона), в пространство, окружающее каналец (рис.2.25). Что же касается почечных канальцев, то при помощи переносчика Na+/K+/2Cl- локализованного на апикальной поверхности клеток эпителия, соединенных друг с другом плотными контактами, происходит замещение на определенные ионы соответственно градиенту Na+. На базолатеральной поверхности этих же клеток, при помощи Na+/K+ насоса, 3 Na+ перемещаются в околоканальцевую жидкость, а 2К+ - в цитоплазму (рис.2.25).

49

Рис.2.25. Механизм образования гипертонического раствора вокруг трубочек мозгового вещества почки, в результате работы переносчиков и насосов на апикальной и базальной частях эпителия покрывающего восходящее колено петли Генле.

Каналы Cl-, на той же поверхности перемещают одноименные ионы в околоканальцевую жидкость. Наряду с этим, ионы К+, поступившие в цитоплазму и с апикальной и с базальной поверхности эпителиальных клеток, возвращаются обратно с помощью открытых каналов К+. Т.о. поступление молекулы NaCl в полость толстой части восходящей петли Генле из околоканальцевой жидкости, с одной стороны приводит к выведению Na+ и Cl- из организма, а с другой стороны является причиной увеличения осмолярности интерстициальной жидкости в мозговом веществе почки. Последнее является основным фактором образования вторичной (концентрированной) мочи.

Эндоцитоз

Не сумевшие поступить в клетку с помощью насосов, каналов и переносчиков, макромолекулы, растворенные в воде вещества, микроорганизмы, различные частички (фрагменты погибших клеток) и др., поступают в нее при помощи эндоцитоза, имеющего различные формы и достаточно сложные механизмы. Термин «эндоцитоз» был впервые использован Кристианом де Дью (1963) для отображения процесса поглощения цитоплазмой производных, расположенных вне клетки.

50

Во всех клетках организма, за исключением эритроцитов, роль эндоцитоза в обеспечении клетки продуктами питания, в ее защите и в поддержании стабильности околоклеточной среды (гомеостаз) является незаменимой.

Процесс эндоцитоза имеет различные классификации. Общепринятым является то, что процесс поглощения крупных частиц и микроорганизмов называется фагоцитозом (рис.2.26-1), а макромолекул и растворенных в воде веществ – пиноцитозом. Если пузырек, образованный в процессе пиноцитоза, колеблется в размере 50-150 нм, то процесс называют микропиноцитозом (рис.2.26 – 5,6,7), а если он более больших размеров (150-200 нм) – то процесс именуется макропиноцитозом (рис.2.26-8).

Рис.2.26. Виды эндоцитоза.

1- фагоцитоз; 2- микропиноцитоз; 3- макропиноцитоз; 4- фагосома; 5- кавеосома; 6- микропиносома; 7- рецептосома; 8- макропиносома; 9- поглощаемая частица; 10комплекс лиганд-рецептор; 11клатриновые белки.

Фагоцитоз Фагоцитозом называют процесс поглощения специальными клетками (макрофаги, нейтрофилы)

бактерий, одноклеточных, грибков, поврежденных клеток и не пригодных околоклеточных веществ (рис.2.27А). Процесс поглощения чужеродных организму частиц является рецептор-зависимым процессом и чаще всего обеспечивается при помощи специальных молекул (опсонины). В роли опсонинов выступают антитела и комплементарные белки крови. Антитела, соединяясь с попавшими в организм микроорганизмами, а комплиментарные белки – с зараженными и погибшими клетками,