3.1.3 Очистка и культивирование эмбриональных клеток свиной печени

 

Центрифугированием клеток в прерывистом фиколловом градиенте добивались очистки клеточной суспензии и удаления клеточного детрита, элементов периферической крови, гемопоэтических клеток эмбриональной печени, крупных фрагментов, поврежденных клеток. Выбранный способ дезагрегации позволил получить взвесь микрофрагментов по 2-5 клеток

Из одного грамма ткани печени, после разделения клеток в фиколловом градиенте в среднем выделяли 8 млн. клеток (8,8±0,6 х 10⁶; n=7). В 50 мл суспензии содержалось примерно 40 млн. клеток (40,6 ± 1,1 x 10⁶; n=7). Степень жизнеспособности клеток после выделения и очистки составила 98,7±0,2% (n=15).

Культивирование проводили в стандартных условиях. Количество клеток увеличивалось с 40 x 10⁶ , засеянных во флакон, до 135 x 10⁶ после 5-ти суточной культивации (135,6 ± 2,4 x 10⁶; n=7). Длительность культивации была выбрана на основании известных данных о приобретении гепатоцитами к 5-м суткам культивации максимальной пролиферативной активности и детоксикационных свойств.

В процессе приготовления культуры клеток печени добивались элиминации клеточного детрита и нежизнеспособных клеток печени. При гистологическом исследовании по окончании культивации в препарате обнаруживали ассоциации, состоящие из плотно прилегающих друг к другу эмбриональных ГЦ и непарехиматозных печеночных клеток (рис. 3.2). В небольшом количестве встречаются и клетки гемопоэтического ряда. Ядра эмбриональных гепатоцитов довольно крупные, округлой формы. Ядрышки (два-три) контурируются отчетливо, гетерохроматин практически отсутствует. Цитоплазма окрашивается толуидиновым синим равномерно, но в отдельных гепатоцитах отчетливо просматриваются совершенно светлые участки.

 

Рис. 3.2. Культура эмбриональных клеток свиной печени. 1 – гепатоцит; 2 – непаренхиматозная клетка; 3 – клетка гемопоэтического ряда

 

 

3.2.Консервация клеток

3.2.1. Приготовление среды для криоконсервации

Известна среда для консервации гепатоцитов, содержащая в качестве криопротектора 20% -ный раствор ДМСО, где соотношение криопротектора с количеством взвеси гепатоцитов составляет 1:1 (Маргулис М.С.,1992).

К недостаткам данной среды следует отнести токсичность консерванта по отношению к гепатоцитам, невозможность полного удаления ДМСО из клеток, так как он относится к внутриклеточным консервантам, закисление среды до рН = 6,8-7,0 при помещении клеток печени в среду для замораживания, необходимость применения больших объемов отмывающих растворов и многократного центрифугирования, отсутствие питательных компонентов.

Таким образом, предстояло определить состав среды для криоконсервации и криопротектор. Нами разработана оригинальная пропись среды, содержащей в качестве криопротектора поливинилпирролидон, который является внеклеточным консервантом, и оказался эффективным для консервации эмбрионов мыши. В качестве жизнеобеспечивающих компонентов дополнительно включены питательная среда RPMI, использованная нами для культивации, 1% раствор альбумина человеческого, который с успехом был применен ранее для консервации чувствительных клеток, калия оротат.

Включению в пропись последнего ингредиента предшествовало экспериментальное исследование. Известна потеря внутриклеточного К+ в процессе криоконсервации, что совпадает с закислением среды и гибелью клеток. Поэтому мы исследовали жизнеспособность культуры клеток печени при различных концентрациях К+ в консерванте в режиме “заморозка-оттаивание”. Результаты представлены в табл. 3.4.

Таблица 3.4

Жизнеспособность культуры клеток печени при различных концентрациях ионов К+ в среде при криоконсервации (“заморозка-оттаивание”)

 

Содержание К+ (масс-частей)	Жизнеспособность культуры клеток печени (%), M ± m	PU
1/1	55,4±3,2	0,0004
1/2	66,3±1,4	0,007
1/3	94,7±1,7	-
1/4	93,0±1,9	0,004

Примечание: содержание К+ выражено по отношению к частям 1% водного раствора альбумина, добавляемого в клеточную суспензию на среде RPMI; значимость различий опередена по сравнению с соотношением 1/3.

Таким образом, оптимальным соотношением оказалась 1 часть калия оротата и 3 частей 1% водного раствора раствора альбумина.

Отметим еще одно преимущество использования калия оротата в среду для криоконсервации. На основании исследования мазков-отпечатков, выполненных после деконсервации, установлено, что при использовании оригинальной прописи не было адгезии клеток в единый конгломерат, что наблюдали в случае применения сред В.М. Моргулиса и С.С. Лаврика.

рН использованной среды доводили до 7,6 в силу соображений, представленных выше. Соотношение компонентов (мас. ч.) представлено в табл. 3.5.

Таблица 3.5

Соотношение компонентов в использованной среде для криоконсервации культуры эмбриональных клеток свиной печени

 

Компонент	Соотношение (мас.ч.)
Среда RPMI	10-11
Поливинилпирролидон	1 – 2
1% раствор альбумина человеческого	3 - 3,6
Калия оротат	1 - 1,2