- •Список сокращений
- •Оглавление
- •Глава 2. Материалы и методы исследования 29
- •Глава 3. Получение криоконсервированной культуры эмбриональных клеток свиной печени для ксенотрансплантации 41
- •Глава 4. Оценка эффективности ксенотрансплантации криоконсервированной культуры клеток эмбриональной печени в коррекции острого токсического повреждения печени 54
- •Глава 5. Структурная оценка влияния ксенотрансплантации культуры эмбриональных клеток печени 69
- •Введение
- •Применение клеток печени для коррекции острой печеночной недостаточности (обзор литературы)
- •1.1 Способы клеточной метаболической поддержки в коррекции печеночной недостаточности
- •1.2. Способы коррекции острой печеночной недостаточности в эксперименте
- •1.2.1. Моделирование острой печеночной недостаточности
- •1.2.2. Механизмы острого токсического повреждения печени при введении сСl4
- •1.2.3.Критерии эффективности метаболической клеточной коррекции опн
- •1.3. Трансплантация гепатоцитов в коррекции острой печеночной недостаточности
- •1.3.1. Способы приготовления гепатоцитов для трансплантации
- •1.3.2. Криоконсервация
- •1.3.3.Приготовление препарата для ксенотрансплантации
- •1.3.4. Способы ксенотрансплантации
- •Глава 2. Материалы и методы исследования
- •2.1 Общая характеристика экспериментального материала
- •2.2.2.1. Культура клеток печени
- •2.2.2.2. Приготовление ткани плаценты для ксенотрансплантации
- •2.2.2.3.Приготовление питательной среды для инъекции
- •2.2.3. Методы лабораторного контроля
- •2.2.3.1.Определение массы печени
- •2.2.3.2.Определение биохимических показателей сыворотки крови
- •2.2.3.3.Исследование показателей системы гемостаза
- •2.2.4.Методы морфологического исследования
- •2.3.Методы статистической обработки
- •Глава 3. Получение криоконсервированной культуры эмбриональных клеток свиной печени для ксенотрансплантации
- •3.1.Технология получения культуры клеток печени
- •3.1.1 Дезагрегация печеночной ткани
- •3.1.2. Оптимизация рН среды для культивации клеток
- •3.1.3 Очистка и культивирование эмбриональных клеток свиной печени
- •3.2.Консервация клеток
- •3.2.1. Приготовление среды для криоконсервации
- •3.2.2. Сравнительная оценка эффективности криоконсервации культуры эмбриональных клеток свиной печени
- •3.3. Получение препарата и ксенотрансплантация
- •Глава 4. Оценка эффективности ксенотрансплантации криоконсервированной культуры клеток эмбриональной печени в коррекции острого токсического повреждения печени
- •4.1.Течение острого токсического повреждения печени на фоне метаболической коррекции
- •4.1.1. Ход эксперимента
- •4.1.2. Летальность в экспериментальных группах
- •4.2. Динамика биохимических показателей при остром токсическом повреждении печени под влиянием ксенотрансплантации криоконсер-вированной культуры эмбриональных клеток печени
- •4.2.1. Уровень альбумина в сыворотке крови
- •4.2.2. Уровень холестерина
- •4.2.3. Уровень билирубина
- •4.2.4. Активность индикаторных ферментов
- •4.3. Динамические изменения некоторых показателей системы гемостаза
- •4.3.1. Уровень фибриногена в плазме крови
- •4.3.2. Вязкость крови
- •4.3.3. Гематокрит
- •4.3.4. Агрегация тромбоцитов
- •Глава 5. Структурная оценка влияния ксенотрансплантации культуры эмбриональных клеток печени
- •5.1. Морфологическое исследование зоны трансплантации
- •5.2. Макроскопическая характеристика печени животных
- •5.3. Характеристика строения печени при световой микроскопии
- •5.4. Ультраструктура гепатоцитов при остром токсическом повреждении печени, корригированном ксенотрансплантацией культуры эмбриональных клеток печени
- •5.5. Содержание днк в ядрах гепатоцитов
- •Заключение
- •Практические рекомендации
- •Список использованной литературы
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1 Общая характеристика экспериментального материала
Исследование выполнено на основании 2 серий подострых экспериментов на 300 белых крысах-самцах породы Вистар с массой тела 200-250 г. Возраст животных был не менее 6 месяцев.
У всех экспериментальных крыс моделировали острое токсическое повреждение печени. Через сутки после индукции острого токсического повреждения печени животных относили к экспериментальным группам методом случайного распределения , таким образом, в исследование вводили животных с индуцированной ОПН. Отправной точкой эксперимента было введение крысам препарата, определяющего в дальнейшем их групповую принадлежность. В первой серии опытов (120 животных) проведено исследование летальности под влиянием КТ криоконсервированной культуры эмбриональных клеток свиной печени (ОГ) и после введения физиологического раствора (КГ 1), питательной среды для культивации клеток печени (КГ 2) и взвеси ткани плаценты человека 12-недельного внутриутробного развития (КГ 3) - табл.2.1.
Таблица 2.1
Распределение животных на группы в первой серии эксперимента (исследование летальности в условиях корригированного ОТП)
Номер группы |
Характер воздействия |
Количество животных |
1 (основная) |
Подкожная инъекция 2х106 криоконсервированной ККП в 1 мл взвеси |
30 |
2 (КГ 1) |
Подкожная инъекция 1 мл физиологического раствора |
30 |
3 (КГ 2) |
Подкожная инъекция 1 мл питательной среды |
30 |
4 (КГ 3) |
Подкожная инъекция плаценты в 1 мл взвеси |
30 |
Всего: |
120 |
|
Контролировали летальность на протяжении 6 суток эксперимента.
Во второй серии экспериментов (180 животных) проводили исследование показателей гомеостаза (масса печени, биохимические тесты и оценка системы гемостаза) и морфологии печени под воздействием ксенотрансплантации ККП (основная группа) и введение физ. раствора (КГ1) и питательной среды (КГ2) - табл.2.2.
Таблица 2.2
Распределение животных на группы во второй серии экспериментов (исследование показателей гомеостаза в условиях корригированного ОТП)
Номер группы |
Характер воздействия |
Количество животных |
1 (основная) |
Подкожная инъекция 2х106 криоконсервированной ККП в 1 мл взвеси |
60 |
2 (КГ 1) |
Подкожная инъекция 1 мл физиологического раствора |
80 |
3 (КГ 2) |
Подкожная инъекция 1 мл питательной среды |
40 |
Всего: |
180 |
|
Выживших животных каждой группы выводили из эксперимента на 2,4 сутки (по 6 крыс в каждой группе), 5 сутки (в группах 2 и 3) и 6 сутки (в группе 1). Проводили забор крови для оценки выбранных биохимических показателей и системы гемостаза, проводили аутопсию, взвешивали печень, ее ткань подготавливали для последующего патоморфологического исследования. Кроме того, у крыс 1 группы иссекали ткани в зоне инъекции культуры клеток печени для патоморфологического исследования.
2.2. Характеристика методов исследования
2.2.1.Моделирование острого токсического повреждения печени
Исследования проводили в лаборатории экспериментальной хирургии института хирургии ВСНЦ СО РАМН (дир. – профессор Е.Г. Григорьев). Животных содержали в условиях вивария при свободном доступе к пище и воде на рационе питания, соответствующем нормативам ГОСТа «Содержание экспериментальных животных в питомниках НИИ», 1978 года.
Моделирование острого токсического повреждения печени выполняли путем подкожного введения ЧХУ чистого для анализов (ЧДА) из расчета 0,5 мл\100г массы животного по А. Фишеру (1961) [68].
2.2.2.Приготовление препаратов для ксенотрансплантации
Фетальную ткань плаценты выделяли в лаборатории биологически активных веществ ИМК "Клиника" (дир.- доктор мед. наук Рунович А.А.). Методику выделения и культивирования эмбриональных клеток печени разрабатывали в лаборатории биологически активных веществ ИМК "Клиника" и в отделе трансплантационных методов лечения ВСНЦ СО РАМН (под руководством профессора Морозова Ю.И.).