3.2.2. Сравнительная оценка эффективности криоконсервации культуры эмбриональных клеток свиной печени

Результаты криоконсервации в трех режимах с использованием различных сред представлены в табл. 3.6.

Таблица 3.6

Жизнеспособность клеток после криоконсервации с применением различных сред

Среда для криоконсервации	Режим криоконсервации
	Заморозка-оттаивание (n=15)	Хранение в течение 2 мес (n=15)	Хранение в течение 6 мес (n=15)
Среда М.С. Маргулиса (1992);	83,4±0,7*	65,4±0,7*	59,8±0,6*
Среда С.С. Лаврика (1990)	77,8±1,2*	-
Разработанная среда	96,5±0,8	89,6±1,3	86,7±0,9
	P<0,001
		P=0,089

Примечание: *- значимость различий, определенная по сравнению с результатами криоконсервации с применением оригинальной среды, p_t<0,0001

 

Оригинальная пропись позволила сохранять культуру с высоким показателем жизнеспособности на протяжении 6 мес. Были отмечены существенные различия по сравнению с контролем (среды М.С. Маргулиса и С.С. Лаврика). Кроме того, укажем на статистически значимое (p<0,001) снижение жизнеспособности культуры при криоконсервации на протяжении 2 мес. В дальнейшем наблюдали лишь тенденцию к снижению этого показателя к 6 мес (p=0,089).

При гистологическом исследовании деконсервированной суспензии клеток были выявлены три разновидности клеток (рис. 3.3). Первая группа представлена преимущественно агрегатами клеток по 4-10 клеток с сохранившимися на значительном протяжении межклеточными контактами. Отмечается целостность мембран, ядра крупные, округлой формы. Ядрышки (одно или 2) контурируются отчетливо. Цитоплазма окрашивается толуидиновым синим неравномерно. Вторая, довольно представительная группа клеток характеризуется тотальной мультивезикуляцией элементов эргастоплазмы. Набухшие ядра в таких клетках содержат эухроматин и четко контурируемую ядерную оболочку. Третья, также многочисленная группа изолированных гепатоцитов преимущественно оваловидной формы с морфологическими признаками вакуолизации цитоплазмы и фрагментации элементов эндоплазматической сети.

Рис. 3.3. Культура эмбриональных клеток печени после 6-месячной криоконсервации. 1 – гепатоцит; 2 – непаренхиматозная клетка; 3 – группа вакуолизированных клеток

 

3.3. Получение препарата и ксенотрансплантация

Методика деконсервации была стандартной. Мы были лишены необходимости элиминировать криоконсервант, поскольку компоненты среды были нетоксичными и, кроме того, каждый сам по себе обладал известным лечебным воздействием.

Количество пересаживаемых клеток составляло 2 х 10⁶ в 1 мл взвеси, что достаточно для протекции при ОПН согласно данным литературы.

Зона трансплантации – в наших экспериментах подкожная жировая клетчатка – не является оптимальной. Мы остановились на этой локализации, чтобы избежать дополнительной травмы при манипуляции (размещение донорской ткани в печени либо селезенке потребовало бы лапаротомии, что могло бы увеличить летальность; внутрибрюшинное пункционное введение донорского материала ухудшает возможность морфологического контроля). Кроме того, старались исключить возможность миграции перенесенных клеток в печень в ранние сроки после КТ.

В заключение главы резюмируем результаты. На основании известных методик выделения, культивации и ксеноконсервации клеток печени была разработана технология применительно к свиной эмбриональной ткани. В эксперименте in vitro обоснованы режимы выделения клеток и состав среды для культивации и криоконсервации донорского материала. Для ксенотрансплантации была приготовлена культура клеток, содержащая ассоциации гепатоцитов и непаренхиматозных клеток печени (комплексы по 4-10 клеток), с высокой степенью жизнеспособности после длительной криоконсервации - 86,7±0,9% через 6 мес.

Оценим теперь эффективность КТ криоконсервированной культуры ЭКП для коррекции CCl₄ - индуцированной ОПН на классической модели.