1.3. Трансплантация гепатоцитов в коррекции острой печеночной недостаточности

Если показания к применению метаболической клеточной коррекции при поражениях печени определены, то вопросы механизмов саногенного воздействия, технологии, а следовательно, технологии ТГЦ до сих пор дискутируются в дитературе. Обратимся к известным данным.

1.3.1. Способы приготовления гепатоцитов для трансплантации

В 1925 г. Харрисоном [50, 135] впервые был выделен изолированный ГЦ, который явился объектом морфологического, функционального и биохимического исследований. В 1943 г. W.Schneider и V.Potter [225] вновь сообщили о возможности разделения органа на изолированные клетки, которые способны осуществлять органоспецифические функции. В 1956 г. Sorrentino [58] применил гомогенат печени в биоискусственной поддерживающей системе с хорошим результатом, воспроизведенным в 1957-58 гг. Kimoto в экспериментах на гепатэктомированных животных, а затем и в клинике [22].

Систематические исследования в этом направлении начались с 1969 г., когда были разработаны методы получения изолированных клеток печени [83, 136].

Получение культуры клеток печени

Для получения чистой культуры изолированных ГЦ используются методики с применением механических и химических воздействий на ткань. Извлеченную печень перфузируют до достижения разрыва клеточных связей различными растворами, содержащими энзимы (трипсин, коллагеназу, эластазу, панкреатин, папаин) или вещества, связывающие двухвалентные ионы (этилен-диаминтетраацетат, версен, секвестрен, хелатон), в отдельности или в сочетании друг с другом [54, 65, 75].

После этого измельченную ткань печени в присутствии одного из названных дезагрегантов подвергают перемешиванию на магнитной мешалке, чтобы отделить взвесь чистых ГЦ. Технические приемы подобного выделения клеток детально описаны в ряде работ отечественных и зарубежных исследователей [3, 17, 23, 25, 35, 55, 56, 115, 137, 151, 184].

Широкое распространение получил комбинированный метод, разработанный M. Berry и D.Friend [83], в последующем модифицированный [18].

Метод включал в себя ферментативную диссоциацию и последующую механическую обработку ткани печени. Этот способ в зависимости от исходного состояния органа позволяет получить до 50-60 % клеток от массы печени, при этом 80% из них сохраняют свою морфологическую структуру и функциональную активность, т.е. участвуют в синтетических и метаболических процессах и сохраняют высокую интенсивность эндогенного дыхания [134].

Однако следует отметить, что во время процедуры разобщения значительная часть ГЦ теряется [87, 93, 115, 158]. Важным требованием является сохранение присущих in vivo культивируемой ткани метаболических функций [113].

При выделении зрелых свиных ГЦ пик клеточной пролиферации приходится на 4-5 день культивации, тогда как 6-10 дни показали увеличение числа фибробластов в культуре. Измерение детоксикационных функций выявляет пик активности на 4-5 сутки и постепенное снижение к 10 суткам [184, 188].

Важным показателем является жизнеспособность выделенных клеток. При выделении клеток из печени взрослой свиньи этот показатель сорставляет 97-99% [178, 184]. Из 1 г ткани печени взрослой свиньи получают 1,92±0,5 х 10⁷ гепатоцитов при жизнеспособности 93% [205].