5. Максимальные объемы вводимого вирусного материала для лабораторных животных,

в мл

Метод введения	Кролики	Морские свинки	Белые крысы	Белые мыши
Внутрикожно	0,1	0,1	0,05	0,02
Подкожно	5,0	3,0	3,0	0,5
Внутримышечно	5,0	2,0	1,0	0,3
Внутрибрюшинно	10,0	5,0	2,0	1,0
Внутривенно	5,0	2,0	2,0	1,0
Интрацеребрально	1,0	0,3	0,1	0,03
Интраназально	0,3	0,05	0,03	0,02

Очень часто при первичном заражении не выявляется вирус, тогда через эти же биологические системы осуществляют второй и третий пассажи вирусов — «слепые пассажи». При отрицательном результате трех пассажей исследования по выделению активных форм вирусов прекращают.

За зараженными животными ведут наблюдения, отмечая изменения в их поведении, появление специфических симптомов болезни в соответствии с инкубационным периодом данной инфекции.

Действие вируса проявляется на лабораторных и естественно-восприимчивых животных следующим образом: 1) гибелью через определенный период времени; 2) развитием клинических признаков болезни; 3) патоморфологическими изменениями в органах и тканях павших животных.

23) Вскрытие трупов лаб.Животных и получение вируссодержащего материала.

Подготовку трупов мелких лабораторных животных к вскрытию производят следующим образом: животное захватывают пинцетом или руками в резиновых перчатках, кладут брюшком кверху на специально подготовленный столик, покрытый оберточной бумагой, который помещен в эмалированную или оцинкованную кювету. Все четыре лапки животного прикрепляют к столику острыми гвоздями, иглами, булавками. Трупы более крупных лабораторных животных фиксируют в кюветах, на пластинах или досках, не допуская утечки жидкости. Трупы лабораторных животных перед вскрытием обрабатывают спиртом или дезинфицирующим раствором. Основное правило при вскрытии — прикасаться к трупу только инструментами или руками в резиновых перчатках. Вскрытие и исследование трупа производят последовательно в четыре этапа:

1.Отпрепарирование кожи от подкожной клетчатки и мышц. Кожу разрезают от паха до шеи по средней линии; разрез продолжают до подмышечных и подколенных ямок. Кожу оттягивают в сторону и обнажают подкожные, подколенные и подмышечные лимфатические узлы. Отмечают изменения в подкожной клетчатке; кровоизлияния, отек, расширение кровеносных сосудов, наличие новообразований.

2. Вскрытие грудной полости. Поверхность грудной клетки протирают спиртовым тампоном, затем, захватив мечевидный отросток, делают над ним небольшой поперечный надрез и, вставив в этот разрез ножницы, перерезают ребра в местах соединения с хрящами. Вырезанную грудину откидывают кверху, производят осмотр грудной полости, отмечая видимые изменения - наличие экссудата, крови, цвет и внешний вид легких и сердца. *Одновременно с осмотром берут стерильно кусочки легочной и сердечной ткани, которые помещают в сухие стерильные пробирки или чашки Петри.

3. Вскрытие брюшной полости.Для этого производят продольный разрез брюшной стенки от мечевидного отростка вдоль белой линии и поперечный - вдоль реберных дуг; лоскуты брюшной стенки отворачивают влево и вправо. Кишечник оттягивают пинцетом влево до тех пор, пока не обнажатся почки, печень и селезенка.

При осмотре брюшной полости обращают внимание на отклонения от нормы размеров, формы, цвета и консистенции органов, а также наличие новообразований. *Для вирусологического исследования берут кусочки органов брюшной полости и лимфатические узлы.

4. Вскрытие черепной коробки. В некоторых случаях вскрывают черепную коробку. Для этого животное фиксируют в брюшном положении (спиной кверху), делают круговой разрез кожи по шее и, подрезая ушные раковины, стягивают ее вперед. Обнажившуюся крышку черепа удаляют путем ее выламывания, стараясь не повредить головной мозг. Осмотр отделов головного мозга обычно не выявляет патолого-анатомических изменений. *Поэтому берут кусочки мозга из разных отделов и делают препараты-отпечатки на предметном стекле.

Из всех взятых проб органов и тканей приготовляют 10%-е суспензии по известной методике, проводят контрольные посевы на обычные МПА и МПБ на бактериальную загрязненность. До получения результатов суспензии хранят при температуре -20 – -70°С.

24) Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах.

Культивирование вирусов в куриных эмбрионах проводят для следующих целей:

1) первичного выделения вирусов из исследуемого, материала при диагностике вирусных болезней;

2)получения большого количества вируссодержащего материала, необходимого для изготовления биологических препаратов (вакцин);

3)поддержания жизнедеятельности вирусов в лабораторных условиях;

4)титрования вирусов;

5) идентификации вирусов в реакции нейтрализации.Культивирование вирусов в куриных эмбрионах имеет следующие преимущества перед другими биологическими системами:

-чувствительность к большинству зоопатогенных вирусов, низкая зараженность латентными инфекциями, которые часто встречаются у лабораторных животных;

-простая техника -культивирования;

-экономичность

Для культивирования вирусов обычно используют живые эмбрионы 7...13-суточого возраста. Яйца должны быть свежеснесенными (не более 10 сут.), высокого качества, с белой скорлупой и чистыми. Мыть их нельзя, так как при этом закрываются поры, в результате чего нарушается дыхание эмбриона.

Для определения жизнеспособности эмбриона яйца просвечивают на овоскопе. Живой эмбрион подвижен, хорошо видны кровеносные сосуды, наполненные кровью, и пульсация главной аллантоисной вены. Погибшие эмбрионы неподвижны, их кровеносные сосуды запустевают или в них отмечается прерывистость; иногда видны пузырьки газа, поднимающиеся вверх.

При овоскопировании на скорлупе простым карандашом отмечают границу воздушной камеры, место расположения эмбриона и крупные кровеносные сосуды, которые служат ориентирами и позволяют выбрать метод заражения.

Заражают куриные эмбрионы вирусами в боксе с соблюдением стерильности и осторожности. Скорлупу яйца в области воздушного пространства и на стороне расположения эмбриона тщательно обрабатывают спиртом, обжигают, а затем смазывают раствором йода.

Выбор метода заражения зависит от тропности вируса - способности размножаться в определенной ткани, в результате чего происходит преимущественное поражение отдельных органов эмбриона.

Для заражения куриных эмбрионов вирусами наиболее часто применяют следующие методы:

1)на хорион-аллантоисную мембрану;

2)в аллантоисную полость;

3)в желточный мешок.

4)в амнион

*Заражение на хорион-аллантоисную оболочку обычно широко используют для культивирования дерматотропных и нейротропных вирусов (оспы, чумы КРС и др.). С этой целью сбоку яйца на стороне расположения эмбриона концом пинцета, иглой или специальным пробойником прокалывают скорлупу и просверливают небольшое отверстие. То же самое делают и над центром воздушного пространства и осторожно надрывают подскорлупную оболочку. Вируссодержащий материал в дозе 0,1 – 0,2 мл наносят на хорион-аллантоисную оболочку и с помощью резинового баллончика, приставленного к отверстию воздушного пространства, засасывают. Отверстия закрывают расплавленным парафином; куриные эмбрионы помещают в термостат в горизонтальном положении. Гибель эмбрионов наступает через 24...96 ч и более после заражения в зависимости от биологических особенностей вводимого вируса.

*Заражение в аллантоисную полость используют для культивирования вирусов гриппа, болезни Ньюкасла, болезни Ауески и др. Существует 4 способа введения вируссодержащего материала в аллантоисную полость эмбриона. Во всех случаях на стороне расположения эмбриона делают отверстие на скорлупе и подскорлупной оболочке, через которое вводят иглу шприца. Глубина введения при 1-м способе составляет 3 мм, при 2-м - 5 под углом 45°, при 3-м - 10... 12 и при 4-м - 20...25 мм. Доза вводимого вируссодержащего материала составляет 0,1 мл. Отверстия закрывают парафином; зараженные куриные эмбрионы в вертикальном положении помещают в термостат.

*Заражение в амниотическую полость используют для культивирования вирусов гриппа и паротита, которые проникают и размножаются в различных клетках эмбриона, контактирующих с амниотической жидкостью. Для работы используют овоскоп. В центре воздушного пространства прокалывают скорлупу и подскорлупную оболочку, затем иглу с тупым концом направляют в сторону эмбриона до тех пор, пока он не сделает резкий толчок назад. Отверстие закрывают парафином; зараженные эмбрионы в вертикальном положении помещают в термостат.