26. Серологические реакции, их сущность и использование в вирусуологии.

Для диагностики вирусных инфекций животных и человека широко используют различные серологические реакции. Они основаны на

взаимодействии вирусных антигенов со специфическими (гомологичными) антителами.

Вирусы служат антигенами, так как их белки (внутренние и внешние оболочки)

вызывают в организме выработку специфических антител. Антитела накапливаются в основном в сыворотке крови. Они способны соединяться в комплекс «антиген+антитело» только со своим специфичным антигеном. Если антигеном является инфекционный агент

(вирус), то антитела его нейтрализуют; в этом состоит биологическая роль антител.

Взаимодействие антител со своими антигенами возможно не только в живом

макроорганизме, но и вне его (пробирке и др.). На этом основаны принципы действия

серологических реакций (от лат. serum - сыворотка).

Таким образом, серологические реакции - это реакции взаимодействия антител с

антигенами. Если взятая пара «антиген+антитело» гомологична (соответствует) друг другу, то в пробирке образуется комплекс «антиген+антитело», что позволяет обнаружить: 1) по известному антигену неизвестное антитело; 2) по известному антителу неизвестный антиген.

В вирусологии наиболее широко применяют следующие серологические реакции:

1) реакцию нейтрализации (РН); 2) реакцию торможения гемагглютинации (РТГА); 3)

реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА); 4) реакцию связывания комплемента (РСК);

5) реакцию диффузионной преципитации (РДП); 6) реакцию иммунофлуоресценции

(РИФ); 7) реакцию торможения гемадсорбции (РТГАд).

Эти реакции различаются между собой методом определения конечного комплекса

«антиген+антитело», т. е. техникой постановки каждой из них.

Серологические реакции широко используют в вирусологической практике.

1. Для диагностики вирусных болезней человека, животных и птиц по обнаружению неизвестного вирусного антигена и установлению его вида с помощью известных специфических антител, с одной стороны, и обнаружения, титрования неизвестных специфических антител с помощью известного вирусного антигена — с другой.

2. Для серологической оценки поствакцинального иммунитета по нарастанию титра антител в четыре раза и более в парных сыворотках крови (ретроспективная диагностика вирусных болезней). Для этого кровь берут два раза: 1-й раз — в начале болезни, 2-й через 2 нед после первого взятия.

3. Для изучения иммунологического фона среди поголовья животных и птиц по числу сероположительных к тому или иному вирусу с целью прогноза.

4. Для изучения антигенной структуры вируса с помощью моновалентных сывороток к отдельным его компонентам.

5. Для установления антигенного родства вирусов.

6. Для оценки активности диагностических препаратов (гипериммунных

сывороток) и вакцин.

7. Для изучения патогенеза вирусных болезней.

Специфические противовирусные антитела в организме животных и человека

вырабатываются в результате естественного переболевания или иммунизации живыми

или убитыми (инактивированными) вирусными вакцинами. Таким образом, создается

активный приобретенный иммунитет. Пассивный приобретенный иммунитет создается введением в макроорганизм иммунных сывороток крови, гамма-глобулинов за счет содержащихся в них специфических противовирусных антител, а также при введении иммунолактона (молочные антитела) или же передается от матери (через плаценту,

желток яйца, молозиво) и т. д.

При вирусных болезнях в макроорганизме могут быть выработаны четыре группы

антител: вируснейтрализующие, комплемент-связывающие, преципитирующие и антигемагглютинирующие. Однако не все группы антител имеют однозначное значение в

противовирусном иммунитете. Наибольшую роль играют вируснейтрализующие

антитела. Они препятствуют вирусам адсорбироваться на поверхности чувствительных клеток и проникать в них и, кроме того, стимулируют фагоцитоз зараженных вирусами клеток макрофага. В результате этого в цитоплазме макрофага изолируется и обезвреживается скопление инфекционных вирионов и их ядовитых продуктов.

Выработку специфических антител и их титр (количество) в сыворотке крови определяют

с помощью различных серологических реакций в зависимости от вирусов: РН, РТГА,

РНГА, РСК, РДП, РИФ и РТГАд.

В сыворотках крови животных и человека содержатся так называемые неспецифические ингибиторы вирусов. Как и антитела, они являются гуморальным фактором иммунитета; так же нейтрализуют инфекционную и гемагглютинирующую активность вирусов. Как и антитела, свое действие на вирусы неспецифические ингибиторы проявляют не только в организме (ин виво), но и в пробирке (ин витро). В серологических реакциях антитела используют не только в чистом виде, но и в виде сыворотки крови, содержащей определенные антитела. Эта же сыворотка крови содержит и неспецифические ингибиторы, действие которых на антиген складывается с действием антител, что ведет к искажению результатов серологических реакций. Поэтому все сыворотки крови, используемые в серологических реакциях, обязательно предварительно освобождают от неспецифических ингибиторов вирусов. Химическая структура их различна, поэтому и методы освобождения от них сывороток крови иные.По физическим свойствам группы ингибиторов можно разделить на две подгруппы:

термолабильные и термостабильные. Т е рм ол а бильн ы е ин гибит ор ы разрушаются

при прогревании сывороток крови в течение 30 мин при 56...63 °С в зависимости от вида

животного, от которого получена сыворотка. Обычно перед прогреванием сыворотки

разводят физиологическим раствором не менее чем в 2 раза во избежание их свертывания.

Одни т е р мо ст аб ильн ы е ин гибит ор ы выдерживают нагревание до 75 °С,

другие - до 100 °С. От них сыворотки крови можно освободить путем обработки химическими реактивами или хорошо адсорбирующими веществами. Из химических

реагентов наиболее широко используют диоксид углерода (С02), периодат калия (КIO4),

риванол, зимозан и другие, а из адсорбентов - каолин, бентонит, активированный уголь.

Метод удаления термостабильных ингибиторов выбирают в зависимости от вида

животного, от которого получена сыворотка крови, и от вируса, антитела к которому

будут использованы.

1. Разрушение (удаление) ингибиторов диоксидом углерода (С02). Сыворотку крови

предварительно разводят 1:10 дистиллированной водой. Диоксид углерода пропускают

через сыворотку из аппарата Киппа в течение 5...7 мин до помутнения жидкости (С02

образуется в результате реакции между бикарбонатом кальция и разбавленной соляной кислотой); образуется осадок белого цвета. Осадок удаляют центрифугированием в

течение 10 мин при 1500 мин-1. Затем к 0,9 мл надосадочной жидкости добавляют 0,1 мл

8,5%-го NaCl и прогревают при 56 °С в течение 30 мин. Сыворотка готова для постановки

реакции.

2. Удаление ингибиторов каолином. К 0,2 мл сыворотки крови добавляют 0,8 мл

физиологического раствора; смесь прогревают при 56 °С в течение 30 мин (разведение

исследуемой сыворотки 1:5) и добавляют 1 мл 25%-й взвеси каолина в физиологическом

растворе. Полученную смесь встряхивают и оставляют на 20 мин при комнатной

температуре, затем центрифугируют в течение 10...20 мин при 2000 мин-1. Надосадочную

жидкость используют для серологической реакции с учетом, что исследуемая сыворотка

крови разведена 1:10.