Nasonov_E.L._Антифосфолипидный синдром_(Literra,2004)-1

SHS-OOO4.qxd 21.11.2006 16:56 Page 211

ГЛАВА 8. Клиническое значение антифосфолипидных антител

функциональные тесты (АЧТВ, тест с ядом гадюки Рассела, определение каолинового и протромбинового времени). Установлено, что ВА in vitro увеличивает продолжительность фосфолипидзависимых реакций свер тывания крови, воздействуя на Са2+ зависимое связывание протромби на, фактора Xa и Va с поверхностью фосфолипидов, в процессе сборки протромбинового активаторного комплекса (протромбиназы). При по дозрении на АФС крайне желательно использовать набор тестов, так как каждый из тестов в отдельности дает положительные результаты только в 60—80% случаев. Поскольку специфичного прямого теста для определе ния ВА не разработано, для дифференциации между присутствием в плазме ВА и дефицитом факторов свертывания необходима постановка подтверждающих тестов. Для этого можно использовать определение АЧТВ в безтромбоцитарной плазме. У больных с ВА не происходит нор мализации свертывания при смешивании исследуемой плазмы с нор мальной плазмой в соотношении 1:1 или 4:1. Нормализация свертывания при добавлении фосфолипидов в гексагональной фазе (нейтрализует действие ингибиторов) свидетельствует о специфичности ВА к фосфоли пидам2, 3, 7.

Хотя обнаружение в крови ВА нередко лучше коррелирует с клиниче скими проявлениями АФС, чем уровень аКЛ, выявляемых с помощью ИФМ (см. ниже), этот метод имеет определенные недостатки и ограни чения. К ним относятся невозможность определения ВА у больных, по лучающих гепарин, ложноположительные и ложноотрицательные ре зультаты, трудность стандартизации. Например, у беременных нередко получают ложноотрицательные результаты скрининговых тестов, что обусловлено увеличением концентрации циркулирующих факторов свертывания (например фактора VIII).

J. Hanly и соавт.8 описали хромогенный метод определения аФЛ, ос нованный на измерении времени образования тромбина (thrombin gener ation time — TGT), когда в лунки микроплат к смеси нормальной плазмы, тромбопластина и хромогенного субстрата тромбина добавляется плазма больных АФС в соотношении 2:1 и после активации кальцием проводит ся кинетическое измерение генерации тромбина по изменению окраски

субстрата. Показано, что плазма больных АФС, позитивных по ВА и

211

SHS-OOO4.qxd 21.11.2006 16:56 Page 212

Насонов Е.Л. Антифосфолипидный синдром

а также моноклональные аβ2 ГП I обладают способностью уд TGT. По сравнению с тестом на ВА, TGT тест имеет более высо позволяет исследовать одновременно большое

образцов.

к кардиолипину (аКЛ)

реагируют с отрицательно заряженными фосфолипидами — и фосфатидилсерином, образующими комплекс с бел плазмы (β2 ГП I, протромбин или аннексин V)1, 2. Для определе применяют иммуноферментный метод, позволяющий выяв называемые β2 ГП I зависимые аКЛ. аКЛ могут относиться ко

3 основным классам иммуноглобулинов (IgG, IgМ и IgА), но ос клиническое значение имеет определение IgG аКЛ и в меньшей IgM.

распределения результатов ИФМ определения аКЛ не соот закону нормального распределения, имея вид экспоненци кривой, что затрудняет использование параметрических тестов полученных данных. Для стандартизации результа единицы GPL/MPL (IgG/IgM phospholipid binding

которые устанавливаются с помощью контрольных сывороток, лабораторией по стандартизации антифосфолипид

. Имеются также стандарты для количественного определе аКЛ9. Одна единица GPL соответствует фосфолипидсвязываю 1 мкг/мл IgG аКЛ, а одна единица MPL1 мкг/мл IgM

очищенных методом аффинной хроматографии. Пересчет показа ОП исследуемых сывороток в единицы концентрации GPL и осуществляется с помощью построения калибровочной кривой логарифма ОП стандарта от логарифма концентрации представленной уравнением линейной регрессии10, 11. При этом полученных данных превращается из исходно ненор в нормальное, что позволяет использовать параметрические

методы1.

граница нормальной концентрации IgG аКЛ в сыворотке

составляет от 7,0 до 23,0 GPL, IgM аКЛ — от 6,0 до 15,0 MPL12.

212

SHS-OOO4.qxd 21.11.2006 16:56 Page 213

ГЛАВА 8. Клиническое значение антифосфолипидных антител

Результаты анализа преобразованных данных целесообразно приме нять в диапазоне нормальных концентраций аКЛ у здоровых лиц, одна ко трудно интерпретировать при выявлении аКЛ положительных ре зультатов у пациентов с "вероятным" АФС. Так, среди 500 больных СКВ из 53,2% случаев с положительными результатами определения аКЛ, ти тры которых превышали нормальный средний уровень на 2 SD, у 30% больных отсутствовали клинические признаки АФС13. При этом, несмо тря на корреляцию высоких титров аКЛ со степенью выраженности кли нических проявлений АФС, обнаружение аКЛ в любых титрах не всегда связано с данным симптомокомплексом.

Согласно международным рекомендациям, при интерпретации ре зультатов следует использовать не абсолютные значения уровня аКЛ в GPL/MPL, а уровень позитивности (таблица 8.2).

Таблица 8.2. Границы степеней позитивности при оценке результатов определения аКЛ

Другой подход к анализу диагностической точности ИФМ определе ния аФЛ связан с построением графика характеристических кривых (ROC curve, receiver operator characteristic curve) на основе расчета опера ционных характеристик теста (чувствительность, специфичность, про гностическая ценность положительных и отрицательных результатов). При построении графика по оси абсцисс откладывают частоту ложнопо ложительных результатов (1 специфичность, %), а по оси ординат — ча стоту истинно положительных результатов (чувствительность, %)14 16. Значения чувствительности и соответствующие им доли ложноположи тельных результатов определения аФЛ, рассчитанные по всему диапазо

ну точек разделения между нормой и патологией, наносятся на плос

213

SHS-OOO4.qxd 21.11.2006 16:56 Page 214

Насонов Е.Л. Антифосфолипидный синдром

и соединяются сплошной линией. Точка, наиболее близкая к пере рассматривается как оптимальное соотношение чувстви и специфичности. Выбор точки разделения делается с учетом ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

случаев вычисляется коэффициент вероятности, т.е. соотношение вероятностью наличия АФС до и после получения результатов те аФЛ, который может определяться как для значений аФЛ, по высоким, средним, низким и нормальным тит

и для отдельных точек разделения ''cutoff '' (по формуле чувстви 1, 14. Однако большинством авторов исследу ценность результатов определения аФЛ, в значи

мере зависящая от распространенности АФС в популяции. J. C. и соавт.15 применяли анализ ROC кривых у 144 больных с подо на АФС при изучении диагностической точности 23 коммерчес —систем для определения аКЛ и аβ2 ГП I. Диагностическая точ большинства методов определения аКЛ и аβ2 ГП I изотипов IgG и по мере увеличения числа клинических критериев, ис для постановки диагноза АФС. В том случае когда диа

базировался на двух или трех клинических признаках, типич АФС, чувствительность тестирования аКЛ и аβ2 ГП I составля более 67%, площадь под ROC кривой (area under curve — AUC) — до 0,72. Наиболее высокая диагностическая точность тест систем анализа аКЛ и аβ2 ГП I наблюдалась при ис четырех и более клинических критериев АФС (чувствитель

—до 100%, площадь под кривой — более 0,8), что связано с умень числа ложноотрицательных результатов. По данным J.M. Musial

.16, анализ характеристических кривых позволяет установить оп критериальные значения аФЛ, связанные с основными кли симптомами АФС. При исследовании клинического значе

у204 больных АФС положительные результаты тестирования

свысоким риском развития тромбозов (OР: 3,04;

доверительный интервал — ДИ — 95%) и рецидивирующих по (OР: 8,7; 2,8—26,7; ДИ — 95%). Анализ ROC кривых показал,

прогнозирования тромбозов наиболее точным тестом является

214

SHS-OOO4.qxd 21.11.2006 16:56 Page 215

ГЛАВА 8. Клиническое значение антифосфолипидных антител

исследование IgG аКЛ ("cutoff">17,2 GPL; OР: 3,69; 1,8—7,4; ДИ — 95%); рецидивирующих потерь плода — IgG аФИ (фосфатидилинозитол) ("cut off">22,1 ед.; OR: 6,21; 2,1—18,5; ДИ — 95%), IgG aКЛ и IgG аβ2 ГП I; тромбоцитопении — IgM аФИ ("cutoff">6,7 ед.; OР: 1,9; 1,04—3,4; ДИ — 95%). При этом у 6,6% больных с клиническими признаками АФС и не гативными результатами тестирования на ВА и аКЛ обнаружены другие субтипы аФЛ, главным образом IgM аФИ.

В настоящее время предложено большое количество "home made" ме тодик и коммерческих тест систем для иммуноферментного анализа аКЛ. Несмотря на стандартизацию основных методических аспектов ИФМ определения аКЛ, полученные результаты нередко имеют проти воречивый характер. Так, по данным многоцентрового исследования, ча стота обнаружения аКЛ в популяции при использовании 9 различных коммерческих тест систем варьировала от 31 до 60% для IgG аКЛ и от 6 до 50% для IgM аКЛ. При этом наклон графика линейной регрессионной зависимости результатов измерения концентрации аКЛ в единицах GPL

иMPL с помощью стандартов, предоставленных Antiphospholipid Standartisation Laboratory, и калибраторов тест систем составлял 0,159— 0,93 для IgG аКЛ и 0,236—0,836 для IgM аКЛ17. Имеются также данные о более высокой вариабельности операционных характеристик шести ком мерческих и одной “home made” тест систем для определения IgG и IgM аКЛ по сравнению с пятью коммерческими тест системами на IgG и IgM аβ2 ГП I18. Хорошая воспроизводимость результатов в значительной степени зависит от четкого выполнения ряда рекомендаций, разработан ных для иммуноферментного анализа аКЛ. Перед внесением в лунки по листироловых микроплат КЛ растворяют в этаноле либо в смеси этанола

ихлороформа. Для иммобилизации КЛ на твердой фазе лунки планшета высушивают в вакууме либо в течение 18 часов при 4°С. Предотвращение липидного окисления с помощью азота на данном этапе является спор ным вопросом, так как окисление КЛ в целом способствует увеличению его отрицательного заряда и связывающей активности.

Интенсивно изучалась возможность использования в тест системах для иммуноферментного анализа аФЛ, помимо КЛ, других ФЛ, включая

ФИ, ФС, ФЭ, ФХ и различные смеси ФЛ19. Полагают, что обнаружение

215

SHS-OOO4.qxd 21.11.2006 16:56 Page 216

Насонов Е.Л. Антифосфолипидный синдром

субтипов аФЛ при АФС в основном определяется степенью с β2 ГП I и не зависит от специфического взаимодействия ФЛ, за исключением реагирования антител с ФЭ20. E.N.

и S.S. Pierangeli21 предложили определять антитела к смеси ФЛ с разработанной ими тест системы "APhL ELISA kit" для диагно "сомнительного" АФС у больных с отрицательными результатами аКЛ и ВА или с низкими титрами аКЛ. В то же время чув и специфичность данного метода не нашла подтвержде

работе H.M. Day и соавт.22.

участков неспецифического связывания обычно про

спомощью 10% раствора фетальной телячьей или бычьей сы

вфосфатно солевом буфере в качестве источника кофактора который связывается с иммобилизированным на твердой фазе

частично — со свободными участками на поверхности микроплат. подчеркнуть, что любые методические различия, касающиеся бычьей сыворотки, разведения и объема проб в лунке, КЛ (окисление, степень очистки) могут приводить к измене активности β2 ГП I и результатов определения аКЛ. соотношения β2 ГП I зависимых и β2 ГП I независи аКЛ до и после внесения в тест систему экзогенного

используется буферный раствор с добавлением бычьего сыво альбумина или желатина23. Тестируемые сыворотки разво блокирующим буферным раствором, содержащим не только β2 но и другие белки сыворотки быка. Кроме того, в образцах иссле сывороток может присутствовать и собственный β2 ГП I чело В связи с этим при определении аКЛ в сыворотке крови рекомен вычитать ОП лунки без КЛ из ОП лунки с КЛ. При определении помощью ИФМ не рекомендуется предварительное прогревание приводящее к конвертации аКЛ отрицательных образцов в в том числе и у здоровых лиц24, 25. Несмотря на согласно которому использование в тест системе для анализа аКЛ 0,05% буферного раствора детерген

20 позволяет отличить β2 ГП I зависимые от β2 ГП I незави

аКЛ26, имеются данные, что Tween 20 может полностью блокиро

216

SHS-OOO4.qxd 21.11.2006 16:56 Page 217

ГЛАВА 8. Клиническое значение антифосфолипидных антител

вать связывание β2 ГП I с КЛ27, а также удалять КЛ со дна лунок при отмывках28.

Одной из наиболее сложных проблем лабораторной диагностики АФС является недостаточно высокая специфичность аКЛ, что в ряде случаев может приводить к ложноположительной диагностике АФС. Улучшение диагностики АФС связано с необходимостью определения аβ2 ГП I, обладающих большей специфичностью в отношении диагноза АФС.

При внесении очищенных антител больных в тест систему для им муноферментного анализа аКЛ без добавления фетальной сыворотки было показано, что β2 ГП I является кофактором, обязательным для специфического связывания "аутоиммунных" аКЛ, ассоциирующих ся с АФС, подавляя связывающую активность "инфекционных" аКЛ29, 30. Содержание β2 ГП I в иммуноферментном тесте, соответст вующее оптимальному связыванию аКЛ, составляет 8 мкг/мл и бо лее; при концентрации β2 ГП I менее 1 мкг/мл связывающая актив ность аКЛ падает до нуля31. В сыворотке человека β2 ГП I присутст вует в концентрации около 200 мкг/мл, в то время как в бычьей сыво ротке его уровень в 2—3 раза выше32. Большинство, но не все субти пы аКЛ человека связываются с бычьим β2 ГП I33, 34. Количеству аКЛ в тестируемой сыворотке, разведенной 1:100 в 10% растворе феталь ной сыворотки, соответствует адекватный для оптимального связы вания уровень β2 ГП I. Использование блокирующего и разводящего раствора без добавления фетальной сыворотки, содержащей экзоген ный β2 ГП I, приводит к значительному снижению связывающей ак тивности аКЛ32.

Поскольку в препаратах бычьего кардиолипина и фетальной сыворот ки, использующихся при определении аКЛ, содержится β2 ГП I, полага ют, что с помощью стандартного ИФМ можно выявлять как аβ2 ГП I, так и антитела, реагирующие собственно с кардиолипином. Другой под ход к определению аβ2 ГП I основан на использовании иммобилизован ного на твердой фазе аффинно очищенного β2 ГП I34 36. Поскольку аβ2 ГП I имеют низкую аффинность, для их выявления ИФМ необходи

ма высокая плотность иммобилизации β2 ГП I на твердой фазе36, кото

217

SHS-OOO4.qxd 21.11.2006 16:56 Page 218

Насонов Е.Л. Антифосфолипидный синдром

экспрессии "скрытого" эпитопа в молекуле β2 ГП I34. при использовании "высокосвязывающих" полистиро микроплат, подвергнутых рентгеновскому облучению. Преимуще определения аβ2 ГП I, по сравнению с определением аКЛ, не ясно. Полагают, что первый обладает более высокой специ а второй — чувствительностью2. Действительно, стандарт определения аКЛ может давать "ложноположительные" ре за счет выявления "непатогенных", реагирующих только с кар антител, а частота обнаружения "патогенных" β2 ГП I зави

аКЛ может существенно варьировать в зависимости от содержа 2 ГП I в тест системе и эффективности его иммобилизации на фазе. Однако определение аβ2 ГП I также связано с определен методическими проблемами. Во первых, метод не стандартизован уровне; во вторых, на результаты может влиять ряд поддающихся контролю факторов, в том числе способ выделения его низкая стабильность, особенности иммобилизации, свойст

фазы и др.

ряде случаев коммерческие препараты β2 ГП I могут подвергать расщеплению на уровне фрагмента Lys317 Thr318, нахо рядом с фосфолипидсвязывающим сайтом Cys281 Cys288 что приводит к существенной потере функциональной ак β2 ГП I37. Наряду с этим обнаружена способность плазмина Ха расщеплять данный фосфолипидсвязывающий участок

38. Хотя аβ2 ГП I являются главным образом низкоаффинны которые проявляют функциональную активность при бивалентного связывания и высокой плотности антигена, на поверхности облученных микроплат, име количество высокоаффинных антител, взаимодейст

с человеческим или бычьим β2 ГП I, адсорбированным на микроплатах39. По данным R.A.S. Roubey и соавт.36, активность аβ2 ГП I человека проявляется при концен β2 ГП I от 1 до 5 мкг/мл, в то время как J. Guerin и соавт.40 и и соавт.41 использовали концентрацию β2 ГП I в 20 раз

. По мнению T. Koike и E. Matsuura42, высокоаффинные мыши

218

SHS-OOO4.qxd 21.11.2006 16:56 Page 219

ГЛАВА 8. Клиническое значение антифосфолипидных антител

ные моноклональные антитела одинаково эффективно связываются с β2 ГП I, адсорбированным на поверхности необработанных и облу ченных микроплат, а аβ2 ГП I человека не взаимодействуют с β2 ГП I, покрывающим лунки необработанных микроплат. Для эффективного связывания с антителами важное значение имеют распределение и плотность β2 ГП I на твердой фазе, обеспечивающие оптимальное расстояние и корректную пространственную ориентировку каждого его эпитопа относительно молекул аβ2 ГП I. Показано, что димериза ция β2 ГП I вызывает выраженное повышение аффинности поликло нальных аβ2 ГП I у больных АФС, при этом Fab' фрагменты аβ2 ГП I не реагируют с нативным и димеризованным β2 ГП I35, 43. С другой стороны, нельзя исключить экспрессию ранее скрытых эпитопов β2 ГП I в результате конформационных изменений, индуцированных связыванием с аβ2 ГП I42.

Результаты иммуноферментного анализа аβ2 ГП I могут варьиро вать в зависимости от типа буферного раствора, применяемого для на несения антигена на поверхность микроплат. При разведении β2 ГП I карбонатным буфером наблюдается более высокая чувствительность определения аβ2 ГП I, чем при использовании Трис буфера44. Выявле ние низкого и неспецифического связывания аβ2 ГП I обусловлено ре агированием антител больных АФС не только с ФЛ и β2 ГП I, но и с широким спектром белков (протромбин, аннексин V, белок С, белок S), которые могут присутствовать в тестируемых сыворотках и связываться с незаблокированными участками на дне лунок. Однако в целом данная проблема имеет большее значение для иммуноферментного анализа аКЛ, при котором указанные сывороточные факторы могут содержать ся как в исследуемых сыворотках, так и в фетальной бычьей сыворотке. Наряду с этим связывающая активность аβ2 ГП I зависит от количест ва и продолжительности отмывок, так как каждый цикл отмывки может приводить к кумулятивному снижению числа связавшихся низкоаф финных аβ2 ГП I и общему уменьшению чувствительности ИФМ опре деления аβ2 ГП I.

Популяционные исследования предсказательной ценности положи

тельных результатов иммуноферментного анализа аКЛ и аβ2 ГП I для

219

SHS-OOO4.qxd 21.11.2006 16:56 Page 220

Насонов Е.Л. Антифосфолипидный синдром

АФС показали, что аКЛ в целом имеют низкую чувстви и специфичность, а аβ2 ГП I — низкую чувствительность, но специфичность относительно вероятности возникновения при АФС1.

образом, лабораторная диагностика АФС должна основываться аФЛ в сыворотке крови с обязательным использованием методов, включая иммуноферментный анализ аКЛ, исследова

спомощью коагулологических тестов и иммуноферментный анализ

. аКЛ — чувствительный, но неспецифический маркер АФС, уро может варьировать из за низкой межлабораторной сопоста результатов и различий в используемых тест системах. Наличие у АФС связи между повышением уровня аКЛ и увеличением риска тромбозов не исключает значения низкопозитивных, ложнополо результатов тестирования аКЛ как потенциальных тромбоген при атеросклерозе и других заболеваниях, не связанных с

Предсказательная ценность положительных результатов исследова 2 ГП I для постановки диагноза АФС выше, чем у аКЛ и ВА, однако использования аβ2 ГП I в качестве лабораторного критерия АФС необходима дальнейшая стандартизация ИФМ опреде

данного показателя на международном уровне. Общепринятым ла методом диагностики АФС по прежнему остается стандарт выявляющий β2ГП I зависимые аКЛ (глава 9).

класса IgA

данные, касающиеся клинического значения IgA аКЛ противоречивы, а метод не стандартизован45 47, определение не рекомендуют использовать для диагностики АФС. Увели

концентрации IgA может вести к ложноположительным резуль при определении IgA аКЛ48. В целом IgA аКЛ, как и аКЛ других связываются с кардиолипином при участии β2 ГП I49. Хотя в крови IgA аКЛ обычно определяются и IgM аКЛ, и IgG,

возможно изолированное выявление IgA аКЛ14, 50 52. Частота об IgA аКЛ при СКВ колеблется от 1 до 44%, а при первичном

— от 20 до 30%.

220