12 Диссертация Смолянова

102

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 4

1.Разработан первичный стандартный образец для количественного определения антител

кSARS-CoV-2 в фармацевтической субстанции (СОП-ФС-1), идентичный по свойствам, составу и происхождению исследуемым образцам.

2.СОП-ФС-1 аттестован референтным методом в РВН. Титр вируснейтрализующих антител, соответствующий 1:20, позволил присвоить образцу значение активности в установленных нами впервые единицах измерения (антиковидные единицы), равное 20 AKE/мл.

3.Разработана методика количественного определения антител к SARS-CoV-2 методом ИФА с использованием СОП-ФС-1 и тест-систем ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ. Валидационные характеристики разработанной методики позволяют сделать заключение о том, что ее можно применять при определении антител к SARS-СоV-2 в фармацевтической субстанции.

4.Выполнены исследования, по сравнительной оценке, содержания антител к

SARS-CoV-2 в СОП-ФС-1, выраженного в единицах активности АКЕ/мл, относительно референс-

панели NIBSC 20/268, охарактеризованной в принятых ВОЗ единицах связывания BAU/мл.

Установлено, что специфическая активность СОП-ФС-1 составила 96,8±6,8 BAU/мл антител к

SARS-СоV-2. Коэффициент пересчета АКЕ/мл в BAU/мл составил 4,8 для набора реагентов ИФА ГНЦ, 5,0 для набора реагентов ИФА ЕИ.

5.Разработан вторичный стандартный образец для количественного определения антител

кSARS-CoV-2 в фармацевтической субстанции (СОП-ФС-2), значение показателей качества которого соответствует показателям качества СОП-ФС-1 и требованиям к соответствующим показателям качества плазмы для фракционирования. Специфическая активность СОП-ФС-2,

установленная методом ИФА относительно СОП-ФС-1, составила 40 АКЕ/мл. СОП-ФС-2 был использован для рутинного использования в оценке уровня специфической активности в образцах котловых загрузок плазмы крови человека в производстве ЛП ИГЧ против COVID-19.

6. Проведено изучение стабильности разработанного СОП-ФС-1. Установлено, что СОП-

ФС-1 стабилен в течение 21 месяца хранения при температуре -20 оС. Для установления окончательного срока годности наблюдения продолжаются.

7. С использованием СОП-ФС-2 проведено более 200 исследований образцов фармацевтической субстанции для производства ЛП ИГЧ против COVID-19 по показателю специфическая активность – содержанию антител к SARS-CoV-2, выраженному в АКЕ/мл или

BAU/мл, методом ИФА с использованием тест-систем ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ.

103

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К SARS-СОV-2 В ЛЕКАРСТВЕННОМ ПРЕПАРАТЕ

ИММУНОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА ПРОТИВ COVID-19

Определение активности или концентрации действующего вещества в ЛП – важный аспект разработки любого ЛП. Разработка, производство и контроль качества ЛС, в том числе биологических, должны соответствовать специальным требованиям, которые определяются рекомендациями ВОЗ, а также требованиям надлежащих практик (GMP, GLP и т.п.), принятых на международном, межрегиональном или национальном уровнях [144]. В Российской Федерации контроль ЛС осуществляется в соответствии в соответствии с законом об обращении ЛП № 61-ФЗ, требованиями Государственной фармакопеи (ГФ) или по методикам, изложенным в нормативной документации на ЛП [145].

При проведении контроля качества ЛП широко используются СО, что характерно для методов контроля биологических ЛП (БЛС) в целом и биологических методов контроля в частности. При установлении значенияе аттестуемой характеристики рекомендовано использовать количественные физико-химические, иммунохимические или биологические методы испытания, приведенные в фармакопейной статье на соответствующую фармацевтическую субстанцию или ЛП [142].

Для высокой достоверности результатов определения основного действующего вещества ЛП используют СО, с установленными значениями аттестационных характеристик, по которыми проводят сравнение испытуемых ЛП, идентичные по свойствам, составу и происхождению исследуемым образцам. Согласно рекомендациям ВОЗ основной задачей получения стандартного образца является обеспечение постоянства содержания основного компонента СО в процессе хранения, транспортирования и использования, так как изменение этого показателя СО может снижать точность количественного определения специфической активности в препаратах иммуноглобулинов человека. В настоящее время отсутствуют международные стандартные образцы специфической активности для препаратов иммуноглобулина человека против COVID-19. В связи с этим при разработке ЛП ИГЧ против COVID-19 возникла необходимость в самостоятельной разработке стандартного образца для количественного определения антител к SARS-CoV-2 в ЛП ИГЧ против COVID-19.

Стандартные процедуры по созданию СО биологических ЛП включают основные этапы, предусмотренные в системе нормативно-методических документов по государственным СО:

•разработка программы получения нового СО, проведение экспериментальных работ по изготовлению СО,

•разработка программы аттестации и аттестация СО,

104

•исследование и мониторинг стабильности СО.

5.1Разработка первичного стандартного образца для количественного определения антител к SARS-CoV-2 в лекарственном препарате иммуноглобулина человека против COVID-19

На следующем этапе работы требовалось изготовить первичный стандартный образец для количественного определения антител к SARS-CoV-2 в ЛП ИГЧ против COVID-19

(СОП-1). При разработке СОП-1 были использованы рекомендации ВОЗ, в соответствии с которыми СО должен быть идентичным по свойствам, составу и происхождению исследуемым образцам [152]. Также, согласно ОФС, «Стандартные образцы» СО биологического происхождения, как правило, представляют собой аттестованные серии препаратов биологического происхождения.

Основными задачами при получении СОП-1, согласно рекомендациям ВОЗ, являлись:

-создание СО идентичного по происхождению, составу и свойствам анализируемому материалу – ЛП ИГЧ против COVID-19;

-обеспечение постоянства содержания основного компонента стандартного образца в процессе хранения, транспортирования и использования, так как изменение этого параметра может снижать точность количественного определения антител к вирусу SARS-CoV-2 в ЛП ИГЧ против COVID-19.

Поставленные задачи были успешно решены благодаря тому, что сырьем для получения СОП-1 являлась производственная серия П-2 ЛП ИГЧ против COVID-19, по всем показателям качества соответствующая нормативной документации на лекарственный препарат.

Для обеспечения стабильности физико-химических и биологических свойств СО были использованы сахароза в конечной концентрации 28 %, стерильный розлив по 0,1 мл во флаконы,

лиофильное высушивание, герметизация флаконов. Лиофильное высушивание проводилось аналогично высушиванию СОП-ФС-1. Полученный СОП-1 исследовали в соответствии с разработанной нормативной документацией на ЛП ИГЧ против COVID-19.

5.1.1 Оценка качества разработанного стандартного образца для количественного определения антител к SARS-CoV-2 в лекарственном препарате иммуноглобулина человека против COVID-19

Была проведена оценка качества приготовленного СОП-1 по показателям качества препаратов иммуноглобулинов в соответствии с ФС.3.3.2.0007.15 а также по показателям качества лиофилизированных форм (Табл. 5.1).

105

Таблица 5.1 - Основные характеристики качества разработанного стандартного образца для количественного определения антител к SARS-CoV-2 в лекарственном препарате иммуноглобулина человека против COVID-19

106

Было установлено, что значения показателей качества разработанного СОП-1

соответствуют требованиям к соответствующим показателям качества лекарственного препарата против COVID-19 и лиофилизированных форм.

5.1.2 Определение количества антител к SARS-CoV-2 в СОП-1

Согласно ОФС.1.1.0007.18 «Стандартные образцы» биологические СО для количественного определения биологическим методом аттестуют по международному

107

стандартному образцу и выражают активность в условных международных единицах (МЕ) или мкг/мг, единицах тканевой цитопатогенной дозы (ТИЦД), 50% летальной дозы (LD50),

минимальной иммунизирующей дозе (МИД). В случае отсутствия международного стандартного образца, используются значение аттестуемой характеристики биологических СО для оценки специфической активности, например, бляшкообразующие единицы (БОЕ), колонеобразующие единицы (КОЕ), титр вируса и др [146].

В случае выбора единицы измерения показателя специфической активности вируснейтрализующих антител – титр в реакции вируснейтрализации является наиболее широко используемой единицей измерения. На предыдущих этапах исследования была показана возможность замены РВН более удобным и простым методом определения антител к SARS-CoV-

2 в плазме крови человека – методом ИФА, а также возможность аттестации стандартного образца для количественного определения специфической активности в образцах плазмы относительно уровня вируснейтрализующих антител к SARS-CoV-2, определенных в РВН.

Таким образом, было принято решение аттестовать СОП-1 для количественного определения антител к SARS-CoV-2 в препаратах иммуноглобулинов использовать методом ИФА относительно значений, полученных в РВН, и также ввести единицы измерения, которые обеспечат приемлемую корреляцию с методом РВН. Было принято решение, как и в случае с СОП-ФС-1, ввести показатель антиковидной единицы (АКЕ). За 1 единицу АКЕ образца была принята величина, обратная его разведению, обладающему способностью ингибировать появление на монослое культуры клеток Vero цитопатогенного действия SARS-CoV-2 в двух из трех лунок в реакции нейтрализации против 100 БОЕ вируса SARS-CoV-2.

Полученный СОП-1 был протестирован с использованием референтного метода – РВН. В результате проведенных исследований было установлено, что титр

вируснейтрализующих антител в образце СОП в 2-х лунках составил 1/320, в третьей – 1/160

(Табл. 5.2).

Таблица 5.2 – Результаты определения титра ВНА в образцах СОП-1 методом РВН

108

Из представленных выше данных видно, что титр ВНА к SARS-CoV-2 в РВН не отличался в серии препарата и приготовленного из него СОП-1. Таким образом, СОП-1 охарактеризован по вируснейтрализующей активности в установленных нами впервые единицах – антиковидных единицах (АКЕ) и образцу СОП-1 была присвоена активность 320 антиковидных единиц/мл

(AKE/мл).

5.2 Валидация методики количественного определения антител к SARS-СоV-2 в

лекарственном препарате иммуноглобулина против COVID-19 методом ИФА с использованием наборов реагентов ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ

Для дальнейшего количественного определения антител к SARS-CoV-2 в препаратах иммуноглобулинов также, как и в случае с оценкой уровня специфической активности в сырье для производства ЛП ИГЧ против COVID-19, целесообразно использовать коммерчески доступные ИФА наборы реагентов, которые в большом разнообразии представлены на российском рынке при условии пригодности данных тест систем для использования с образцами препаратов иммуноглобулинов.

Из представленных ранее исследований корреляции между методами РВН и ИФА с использованием пулов плазмы было установлено, что коэффициенты корреляции с использованием тест-систем ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ составляли 0,91 и 0,95 соответственно. Такие уровни корреляции свидетельствуют о возможности использования метода ИФА с указанными тест-системами взамен реакции РВН для количественной оценки содержания антител также и в препаратах иммуноглобулинов. Также результаты определения в препаратах иммуноглобулина человека нормального содержания антител, специфичных к SARS-CoV-2 показали минимальное количество ложноположительных результатов, вызванных неспецифическим взаимодействием,

при использовании тест-систем ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ (Табл. 3.1).

Таким образом, для количественного определения антител к SARS-CoV-2 в ЛП ИГЧ против COVID-19 также были предложены тест-системы ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ.

На данном этапе исследований была проведена валидация методики определения концентрации антител к SARS-СоV-2 методом ИФА указанными выше тест системами (ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ ) в соответствии с EMEA/CHMP/EWP/192217/2009 Rev. 1 Corr. 2** 21 July 2011

Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) Guideline on bioanalytical method validation и с ОФС.1.1.0012.15 «Валидация аналитических методик» по перечисленным ниже характеристикам:

•Аналитическая специфичность (specificity);

•Аналитическая область (range);

•Линейность (linearity);

109

•Правильность (trueness);

•Прецизионность (precision) повторяемость (сходимость) и промежуточная

(внутрилабораторная) прецизионность;

•Устойчивость (robustness) [132].

Работы проводились двумя операторами в течение двух дней в двух повторностях с использованием разработанного СОП-1 и трех серий ЛП ИГЧ против COVID-19 (П-1, П-2 и П-

3). Для полученных значений уровней специфических антител (АКЕ/мл) были рассчитаны величины: среднее значение, стандартное и относительное стандартное отклонения (RSD, %).

5.2.1. Валидация методики количественного определения антител к SARS-СоV-2 в

лекарственном препарате иммуноглобулина человека против COVID-19 методом ИФА с использованием наборов реагентов ИФА ГНЦ

В рамках данной работы проводили валидацию методики определения концентрации антител к SARS-СоV-2 методом ИФА с использованием набора реагентов ИФА ГНЦ. Результаты представлены в таблицах 5.3-5.10.

Аналитическая специфичность:

Оценка аналитической специфичности показывает способность аналитической методики однозначно оценивать определяемое вещество в присутствии сопутствующих компонентов. Так как в нашей работе была использована тест система, зарегистрированная как медицинское изделие, оценка перекрестной реактивности была проведена производителем. По данным производителя по результатам испытаний образцов сыворотки (плазмы) крови пациентов,

имевших в анамнезе другие типы коронавируса, HBV, HCV, HIV-1, HIV-2, Adenovirus, Human Metapneumovirus (hMPV) , Parainfluenza virus 1-4, Influenza A, Influenza B, Enterovirus 71, Respiratory syncytial virus, Rhinovirus, Chlamydia pneumoniae , Streptococcus pneumonia,

Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, EBV ни одна из испытанных проб не показала наличие перекрёстной реактивности.

Определение линейности:

Для построения графиков зависимости уровня оптической плотности от специфической активности (концентрации вируснейтрализующих антител) и установления их линейности необходимо было выполнить постановку методики ИФА с использованием набора реагентов ИФА ГНЦ, используя в качестве антигена калибратора серию не менее 5 последовательных разведений разработанного СОП-1. По полученным данным построили графики зависимости оптической плотности от специфической активности СОП-1, результаты представлены на рисунке 5.1.

Рисунок 5.1 - График зависимости отношения lg оптической плотности СОП-1 к log2 кратности его разведения (диапазон концентраций 0,8–0,001 АКЕ/мл) при использовании тест-

системы ИФА ГНЦ

Из рисунке 5.1 видно, что линейная область в анализируемой тест-системе ИФА ГНЦ отмечается в диапазоне приблизительно от 0,006 до 0,24 АКЕ/мл. При концентрации 0,25 АКЕ/мл и выше на графике наблюдается сначала плато кривой и это существенно занижает истинное значение. Поэтому мы повторно провели постановку методики ИФА с применением шести разведений СОП-1 в диапазоне концентраций на пять разведений с шагом разведения в 2 раза от значения 0,006 - 0,2 АКЕ/мл и повторно исследовали линейность. в данном диапазоне калибровочной кривой тест-системы ИФА ГНЦ.

Критерий приемлемости при оценке линейности: наличие линейности в зависимости отношения логарифма оптической плотности от уровня специфической активности СОП-1.

Определение проводили с помощью статистического метода дисперсионного анализа, который позволяет, с учетом всех экспериментальных погрешностей, определить наличие линейности с необходимой доверительной вероятностью (коэффициент корреляции) не менее 0,99.

Из рисунка 5.2 и таблицы 5.3 видно, что отклонения фактических значений концентраций специфических антител для СОП-1, от номинальных значений при количественном определении антител к SARS-CoV-2 набором реагентов ИФА ГЦН в диапазоне концентрация СОП-1 от 0,006

до 0,2 АКЕ/мл не превышают 10%, и на калибровочной кривой как минимум пять точек укладываются в диапазон исследования линейности тест-системы для определения концентрации антител к SARS-СоV-2 в ЛП ИГЧ против COVID-19, и полученные графики имеют коэффициенты корреляции более 0,99, что удовлетворяет критериям приемлемости.