12 Диссертация Смолянова

Точность также является одной из основных характеристик и отражает количество верных

Определение чувствительности и специфичности используемых в исследовании тест-

систем ИФА было затруднено спецификой течения данного заболевания. По некоторым данным количество бессимптомно переболевших может насчитывать более 30 % от всех переболевших,

что затрудняет определение диагностической чувствительности и специфичности относительно диагноза, поставленного по клинической картине заболевания [166, 167]. Также определение затруднено отсутствием золотого стандарта.

Однако с целью определения чувствительности и специфичности были использованы три подхода:

1)определение диагностической чувствительности и специфичности,

2)определения чувствительности и специфичности относительно наличия ВНА с пороговым значение титра 1/20,

3)определения чувствительности и специфичности относительно наличия ВНА с пороговым значение титра 1/40.

Результаты представлены в таблице 3.2.

62

Таблица 3.2 – Определение чувствительности и специфичности ИФА тест-систем

* Примечание:

ЛПР – ложноположительные результаты ЛОР – ложноотрицательные результаты ИПР – истинно-положительные результаты ИОР – истинно-отрицательные результаты

63

вируснейтрализующие антитела к SARS-CoV-2 в группе здоровых доноров

По некоторым публикациям количество бессимптомно переболевших может насчитывать более 30 % от общего числа переболевших [166, 167]. Таким образом в группе здоровых доноров могут быть люди, бессимптомно переболевшие COVID-19 и содержащие вируснейтрализующие антитела. Тогда истинная специфичность тест-систем будет отличаться от измеренной.

Как было указано выше, все тест-системы определили некоторое количество образцов в группе здоровых доноров как положительные. Все они были отправлены на исследование методом РВН. Однако не во всех положительных в ИФА образцах был выявлен титр ВНА.

Исходя из литературных данных отсутствие вируснейтрализующих антител характерно для легкой формы заболевания [168, 169].

Таким образом, на данной выборке образцов невозможно сделать выводы об истинном уровне специфичности ИФА тест-систем разных производителей. Однако можно сделать вывод,

что 1,9% образцов в группе здоровых доноров обладают антителами с титром ВНА более 1/10,

так как из 1106 образцов здоровых доноров 243 образца были положительны хотя бы в одной ИФА тест-системе, из них только 21 образец был положительным в РВН.

Также методом сопоставления результатов ИФА и РВН можно оценить процент ложноотрицательных и ложноположительных результатов относительно титра ВНА (Табл. 3.3).

Наименьший процент ложноотрицательных результатов относительно титра ВНА показала ИФА ВБ, что характеризует ее как тест-систему высокой чувствительности.

Таблица 3.3 – Результаты исследования выборки здоровых доноров методом ИФА и в РВН

Наименьший процент ложноположительных результатов относительно титра ВНА

показали тест-системы ИФА ГНЦ, ИФА ЕИ и ИФА CD, что характеризует их как тест-системы

высокой специфичности.

64

3.6Оценка коррелятивной связи между титрами антител в образцах,

полученными в РВН, и результатами исследования антител, полученными методом ИФА с использованием различных наборов реагентов, в образцах плазмы

Исследование нормальности распределения данных в выборках результатов ИФА и

РВН

Для исследования коррелятивной связи между количеством антител в образцах плазмы

крови доноров и реконвалесцентов, полученных методом ИФА и в РВН, на первом этапе

проводили исследование нормальности распределения выборок. Результаты исследования

представлены в таблице 3.4.

Данные результаты достоверно свидетельствуют об отсутствии нормального

распределения в выборках.

Таблица 3.4 – Исследование нормальности распределения данных в выборках результатов, полученных с использованием различных наборов реагентов по методике ИФА и в РВН

65

Оценка коррелятивной связи между титрами ВНА и КП, полученными методом

ИФА, в образцах Банка Образцов

Поскольку данные в выборках не проходят тест на нормальность распределения,

корреляционный анализ проводили по методу Спирмена. Результаты исследования представлены в таблице 3.5 и на рисунке 3.2.

По результатам исследования был определен коэффициент корреляции Спирмена (r) для тест-систем ИФА разных производителей, который составил от 0,517 до 0,827 при уровне значимости p<0,0001. Корреляция между уровнем IgG, определенным в ИФА, и ВНА в образцах плазмы крови может считаться достоверной при коэффициенте выше 0,8, что показано для ИФА ГНЦ, ИФА ЕИ и ИФА Гамалея, коэффициенты корреляции которых составляют 0,8269, 0,820 и 0,800 соответственно. Такой уровень значений соответствует средней корреляции, что не является достаточным для использования без модификации процедуры отбора сырья,

приемлемой для производства ЛП ИГЧ, содержащего вируснейтрализующие антитела к SARS-

CoV-2.

Относительная низкая степень корреляции между методами ИФА и РВН в индивидуальных образцах может быть связана с тем, что не все антитела, специфичные к RBD домену, обладают вируснейтрализующим действием, и содержание вируснейтрализующих антител может отличаться в индивидуальных образцах. Однако при производстве ЛП ИГЧ используют крупные пулы, состоящие из более чем 1000 образцов, в которых индивидуальные различия усредняются.

Таблица 3.5. - Результаты корреляционного анализа данных, полученных методами ИФА и РВН

66

Рисунок 3.2 – Взаимосвязь между содержанием антител, определенным с помощью тест-систем разных производителей, и титром ВНА, определённым с реакции вируснейтрализации

Содержание антител, определенное с помощью ИФА тест-систем, выражено через значение КП.

А. содержание антител, определенное с помощью ИФА ГНЦ и РВН Б. содержание антител, определенное с помощью ИФА ГНЦ и РВН, выражено в

логарифмической шкале, с основанием 2, В. содержание антител, определенное с помощью ИФА ЕИ и РВН

Г. содержание антител, определенное с помощью ИФА ЕИ и РВН, выражено в логарифмической шкале, с основанием 2,

Д. содержание антител, определенное с помощью ИФА ВБ и РВН Е. содержание антител, определенное с помощью ИФА Гамалея и РВН Ж. содержание антител, определенное с помощью ИФА Литех и РВН

З. содержание антител, определенное с помощью ИФА CD и РВН

67

При анализе корреляции между сравниваемыми методами с использованием пулов плазмы

(смесь 10 индивидуальных образцов с одинаковым титром вируснейтрализующих антител,

определенным в РВН) было установлено, что коэффициенты корреляции для методов РВН и ИФА с использованием тест-систем с наиболее высоким уровнем корреляции в индивидуальных образцах ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ составляли 0,91 и 0,95 соответственно (Табл. 3.6).

Таблица 3.6 – Уровни антител, полученных в РВН и ИФА с использованием тест-систем ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ (n=37 минипулов)

Такие уровни корреляции свидетельствуют о возможности использования метода ИФА с использованием тест-систем ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ взамен метода РВН для количественной оценки содержания антител.

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 3

1. Разработаны научно-методические подходы к выбору метода определения специфиче-

ской активности противовирусных иммуноглобулинов, определено, что классическим методом определения специфической активности лекарственных препаратов противовирусных имму-

ноглобулинов является реакция вируснейтрализации, а также установлена тенденция перехода на методы in vitro, с использованием метода иммуноферментного анализа (ИФА), в частности для количественного определения антител к SARS-CoV-2.

2.Проведено исследование содержания антител, специфичных к SARS-CoV-2,

методом ИФА и титра ВНА в РВН в образцах ЛП ИГЧ нормального производства АО «НПО

«Микроген», произведенных до вспышки COVID-19. Установлено, что в исследуемых образцах ЛП ИГЧ нормального не обнаружена ВНА в отношении SARS-СoV-2 (титр ВНА менее 1:4). При этом в отдельных сериях препарата методом ИФА были определены антитела, специфичные к

SARS-CoV-2.

68

3. Создан Банк образцов плазмы крови человека, включающий реконвалесцентов и здоровых доноров, объемом в 1499 образцов. Проведено исследование образцов плазмы человека

(реконвалесцентов и здоровых доноров) на содержание антител в РВН и с использованием тест-

систем ИФА. Максимальную диагностическую чувствительность на данной выборке образцов показала тест-система «Набор реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса G к SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2-IgG-ИФА-БЕСТ) по ТУ 21.20.23-107-23548172-2020 АО

«Вектор-Бест», Россия» (ИФА ВБ). Однако его относительно низкая специфичность позволяет характеризовать данный набор преимущественно как скрининговый.

4. Проанализирована корреляция между результатами измерения антител к SARS- CoV-2 в образцах плазмы крови человека методами РВН и ИФА тест-системами разных производителей. Установлено, что максимально высокие коэффициенты корреляции показали результаты определения антител с помощью ИФА тест-систем производства ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России (ИФА ГНЦ), Евроиммун Медицинише Лабордиагностика ГмбХ

(ИФА ЕИ) и ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалея» Минздрава России (ИФА Гамалея), которые составили 0,8269, 0,8204 и 0,8080 соответственно (определение коэффициента корреляции по Спирмену). Такой уровень значений соответствует средней корреляции, что не является достаточным для использования без модификации процедуры отбора сырья, приемлемой для производства ЛП ИГЧ, содержащего антитела к SARS-CoV-2.

5.В результате проведенных сравнительных исследований оценки содержания антител к

SARS-CoV-2 в пулах плазмы крови человека с использованием методов реакции вируснейтрализации (РВН) и ИФА было установлено, что коэффициенты корреляции для сравниваемых методов при применении тест-систем для ИФА производства ФГБУ «НМИЦ гематологии» МЗ РФ (ИФА ГНЦ) и Евроиммун Медицинише Лабордиагностика ГмбХ, Германия

(ИФА ЕИ) составили 0,91 и 0,95 соответственно, что свидетельствует о возможности использования метода ИФА с указанными тест-системами взамен РВН для определения антител к SARS-CoV-2 в фармацевтической субстанции и лекарственном препарате иммуноглобулина человека против COVID-19.

69

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

АНТИТЕЛ К SARS-COV-2 В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ (ПЛАЗМЕ

КРОВИ ЧЕЛОВЕКА)

Следующим этапом работы при производстве ЛП ИГЧ после отбора сырья является формирование из индивидуальных образцов плазмы пула котловой загрузки, который является активной фармацевтической субстанцией. Уровень специфической активности в фармацевтической субстанции напрямую влияет на уровень специфической активности в готовом ЛП ИГЧ. Соответственно крайне важным становится выбор или разработка воспроизводимой методики точного количественного определения уровня специфической активности, приемлемой для рутинного применения.

Таким образом, следующей задачей исследования являлась разработка методики,

позволяющей количественно определять уровень антител к SARS-CoV-2 в образцах плазмы с целью отбора сырья, а также в фармацевтической субстанции для производства ЛП ИГЧ против

COVID-19 с использованием коммерческих ИФА тест-систем. Однако стандартный образец или контрольная панель, при помощи которых можно было бы оценить уровень нейтрализующих антител в плазме крови человека с использованием метода ИФА, отсутствовали не только в Российской Федерации, но и в других странах мира.

В связи с этим при разработке ЛП ИГЧ против COVID-19 возникла необходимость в разработке стандартного образца предприятия для количественного определения антител к

SARS-CoV-2 в фармацевтической субстанции (СОП-ФС), аттестованного в единицах измерения в соответствии с рекомендациями ВОЗ, который обеспечивал бы приемлемую корреляцию с методом РВН.

Первичный стандартный образец предприятия для количественного определения антител к SARS-CoV-2 в фармацевтической субстанции (СОП-ФС-1) разрабатывали, соблюдая следующий алгоритм процедур по созданию контрольных образцов биологических ЛП:

-разработка СОП-ФС-1;

-разработка программы аттестации СОП-ФС-1;

-оформление отчета об аттестации СОП-ФС-1;

-разработка спецификации на СОП-ФС-1;

-оформление свидетельства на СОП-ФС-1;

-проект инструкции по безопасному применению СОП-ФС-1;

-макет этикетки на СОП-ФС-1.

70

4.1 Разработка первичного стандартного образца предприятия для количественного

определения антител к SARS-CoV-2 в фармацевтической субстанции

При разработке СОП-ФС-1 были использованы рекомендации ВОЗ [152], в соответствии с которыми разрабатываемый стандартный образец должен быть идентичным по свойствам,

составу и происхождению исследуемым образцам.

Основой для получения СОП-ФС-1 являлась котловая загрузка плазмы человека для фракционирования (объединенные образцы плазмы крови человека, содержащие антитела к

SARS-CoV-2), которая была использована для приготовления первой серии препарата иммуноглобулина человека против COVID-19. Данная плазма по всем показателям качества соответствовала ГФ РФ, ФС.3.3.2.0001.19 «Плазма человека для фракционирования» [164].

Для удобства хранения и применения, а также для обеспечения стабильности физико-

химических и биологических свойств СОП-ФС-1 была разработана лиофилизированная форма стандартного образца, включающая следующие стадии получения: внесение в препарат раствора сахарозы до конечной концентрации 2 %; стерильный розлив в асептических условиях по 0,1 мл;

лиофильное высушивание; герметизация флаконов. При оценке качества разработанного СОП-

ФС-1 было установлено, что он полностью соответствует ФС.3.3.2.0001.19 «Плазма человека для фракционирования», а также показателям качества лиофилизированных форм.

4.1.1. Лиофильное высушивание

Для приготовления СОП-ФС-1 образцы пула котловой загрузки плазмы человека для фракционирования, который был использован для приготовления первой серии ЛП иммуноглобулина человека против COVID-19, разлили во флаконы по 0,1 мл, затем заморозили в закрытых колпаками металлических кассетах в низкотемпературных камерах при температуре от минус 40 до минус 60 °С не менее 16 ч с принудительной вентиляцией. Режим замораживания образцов СОП-ФС-1 представлен на рисунке 4.1.

Рисунок 4.1 – Режим замораживания образцов при приготовлении первичного стандартного образца предприятия для количественного определения антител к SARS-CoV-2 (СОП-ФС-1)