12 Диссертация Смолянова

111

Рисунок 5.2 - Калибровочный график зависимости отношения оптической плотности к уровню специфической активности СОП-1 при количественном определении антител к SARS-

CoV-2 набором реагентов ИФА ГЦН

Таблица 5.3 - Отклонения фактических значений концентраций специфических антител для СОП-1, от номинальных значений при количественном определении антител к SARS-CoV-2 тест-системой ИФА ГЦН

112

Параллелизм

Для определения линейности дополнительно нами был использован метод сравнения со стандартным или референс-методом. Дополнительно были изучены линейность и параллелизм в соответствии с инструкцией по применению компьютерной программы «Паралайн»,

разработанной в ГИСКе им. Л.А. Тарасевича (Табл. 5.4). В качестве калибратора использовали серию не менее 5 последовательных разведений разработанного СОП-1, в качестве исследуемых образцов - серию не менее 5 последовательных разведений препарата иммуноглобулина человека против COVID-19. Результаты представлены на рисунке 5.3.

Вэтом случае критерием линейности служит параллельность и линейность по отношению

кстандартным образцам стандартного метода. Результаты отражены на рисунке 5.3.

По причине отсутствия коммерчески доступных стандартных образцов использовали образцы 3 серий ЛП ИГЧ против COVID-19, не прошедших лиофильную сушку. Статистическую обработку результатов иммуноферментного анализа проводили с помощью программы

«Паралайн», разработанной в ГИСКе им. Л.А. Тарасевича. По рисунку 5.3 можно судить о параллельности и линейности кривой разработанного стандартного образца по отношению 3

серий ЛП ИГЧ против COVID-19. Статистические данные, полученные при этом, отражены в таблице 5.4.

Таблица 5.4 - Изучение параллелизма при количественном определении антител к SARS-CoV-2 с использованием набора реагентов ИФА ГНЦ

Врезультате было установлено, что зависимости логарифмов оптических плотностей от логарифма кратности разведения для исследуемых ЛП и СОП-1 линейны и эти линии параллельны друг другу, что соответствует критерию приемлемости.

Врезультате проверки установлено, что основное условие выполнено и для любого испытуемого образца ЛП ИГЧ против COVID-19 в пробе с использованием набора реагентов ИФА ГНЦ прямая линия параллельна линии для СОП-1.

Все наблюдаемые серии тест-системы для количественного определения антител к SARS-

CoV-2 с использованием набора реагентов ИФА ГНЦ имеют значение коэффициента корреляции

Определение прецизионности

Данная методика количественного определения антител к SARS-CoV-2 (показатель специфической активности) в ЛП ИГЧ против COVID-19 является оригинальной, . пПри разработке оригинальной методики определяли повторяемость (сходимость) результатов,

получаемых с ее использованием, и дополнительно определяли внутрилабораторную

(промежуточную) прецизионность.

Повторяемость (сходимость):

Повторяемость методики количественного определения антител к SARS-CoV-2

(показатель специфической активности) в ЛП ИГЧ против COVID-19 с использованием тест-

системы ИФА ГНЦ нами была изучена во всем диапазоне калибровочной кривой на 6

однородных образцах в четырех повторностях для 2 операторов. Коэффициенты вариации были вычислены путем расчета стандартных отклонений с учетом средних значений концентрации антител к SARS-CoV-2, которые определяли с помощью регрессионного уравнения для каждого анализа. Такую статистическую обработку полученных результатов проводили отдельно для операторов I и II (Табл. 5.5 и 5.6).

114

Полученные результаты расчета относительного стандартного отклонения для операторов

I и II составили 6,3-13,6 и 5,0-8,0, соответственно.

Таблица 5.5. Изучение сходимости результатов определения концентрации антител к SARS- СоV-2 в лекарственном препарате иммуноглобулина человека против COVID-19 с использованием набора реагентов ИФА ГНЦ (1 оператор, 1 день)

Таблица 5.6. Изучение сходимости результатов определения концентрации антител к SARS- СоV-2 в лекарственном препарате иммуноглобулина человека против COVID-19 с использованием набора реагентов ИФА (2 оператор, 2 день)

Результаты исследований повторяемости показали, что значения относительного стандартного отклонения были ниже 20 %, что удовлетворяет критерию приемлемости.

Определение внутрилабораторной прецизионности:

Далее были проведены исследования по анализу внутрилабораторной прецизионности,

котрую оценивали по результатам постановки 6 однородных образцов в четырех повторностях,

далее рассчитывали объединенное стандартное отклонение (S.D.) и объединенное относительное стандартное отклонение (RSD).

Проведенные исследования внутрилабораторной прецизионности, позволили сделать вывод о том, что объединенное относительное стандартное отклонение внутрилабораторной

115

прецизионности составило не более 14,7% (Табл. 5.7), что удовлетворяет критерию

приемлемости – не более 20 %.

Таблица 5.7. Изучение внутрилабораторной прецизионности результатов определения концентрации антител к SARS-СоV-2 в лекарственном препарате иммуноглобулина человека против COVID-19 с использованием набора реагентов ИФА (2 оператора, 2 дня)

Определение аналитической области:

При определении аналитической области методики (интервала между верхним и нижним значением аналитических характеристик определяемого компонента в объекте анализа)

критерием приемлемости служили приемлемый уровень правильности и внутрилабораторной

(промежуточной) прецизионности.

К величине аналитической области методик предъявляются следующие требования:

- для методики количественного определения должны быть применимы в интервале от 8750

до 1205 % от номинального значения определяемой аналитической характеристики.

Соответственно при определении аналитической области методики использовали значения по диапазону экспериментальных данных, удовлетворяющих линейной модели, от 0,006 до 0,25

АКЕ/мл (Табл. 5.8-5.10)

Полученные результаты расчета относительного стандартного отклонения на вернем и нижнем пределах обнаружения составили не более 9,9% и 9,06%, соответственно, что удовлетворяет критерию приемлемости – не должен превышать 25 %.

116

Таблица 5.8 – Изучение сходимости результатов определения концентрации антител к SARS- СоV-2 в препаратах иммуноглобулинов при определении аналитической области на вернем и нижнем пределах обнаружения с использованием набора реагентов ИФА ГНЦ (1 оператор, 1 день)

Относительное стандартное отклонение на верхних и нижних пределах (близко к LLOQ и

ULOQ) аналитической области, которая находится в пределах 0,25 – 0,006 АКЕ/мл, при определении правильности и внутрилабораторной (промежуточной) прецизионности составило не более 19,1%, что соответствует критериям приемлемости не более 25 %.

Таким образом, валидация методики определения специфической активности количественного определения антител в SARS-CoV-2 с использованием тест-системы ИФА ГНЦ и СОП-1 в качестве калибровочного образца показала, что результаты, полученные двумя

исполнителями, сопоставимы и соответствуют критериям приемлемости методика полностью

соответствует критериям приемлемости.

Таблица 5.9 – Изучение сходимости результатов определения концентрации антител к SARS- СоV-2 в препаратах иммуноглобулинов при определении аналитической области области на вернем и нижнем пределах обнаружения с использованием набора реагентов ИФА ГНЦ (2 оператор, 2 день)

117

Таблица 5.10 – Изучение внутрилабораторной прецизионности (воспроизводимости) результатов определения концентрации антител к SARS-СоV-2 в препаратах иммуноглобулинов при определении аналитической области на вернем и нижнем пределах обнаружения с использованием набора реагентов ИФА ГНЦ (2 оператора, 2 дня)

5.2.2. Валидация методики определения концентрации антител к SARS-СоV-2

методом ИФА в препаратах иммуноглобулинов с использованием набора реагентов ИФА

ЕИ

Результаты валидации методики определения концентрации антител к SARS-СоV-2

методом ИФА с использованием набора реагентов ИФА ГНЦ показали ее применимость с целью использования для выпускающего контроля качества. Однако, при использовании коммерческих тест систем возникает риск непроизводства препарата, если производитель перестанет выпускать данные необходимые реагенты. Соответственно при использовании коммерческих реагентов целесообразно уже на этапе разработки подбирать 2 или даже 3 альтернативных поставщика.

Таким образом, на следующем этапе работы проводили валидацию методики определения концентрации антител к SARS-СоV-2 методом ИФА с использованием набора реагентов ИФА ЕИ. Результаты представлены в таблицх 5.11-5.20.

Аналитическая специфичность

Оценка аналитической специфичности показывает способность аналитической методики однозначно оценивать определяемое вещество в присутствии сопутствующих компонентов. Так как в нашей работе была использована тест система, зарегистрированная как медицинское изделие, оценка перекрестной реактивности к другим видам коронавирусов была проведена производителем. По результатам испытаний образцов сыворотки (плазмы) крови пациентов,

118

имевших в анамнезе SARS-CoV-1, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, HCoVOC43, не показали наличие перекрёстной реактивности (количество положительных проб - 0%),

кроме SARS-CoV-1 (количество положительных проб - 20%).

Определение линейности

Для построения графиков зависимости уровня оптической плотности от специфической активности (концентрации вируснейтрализующих антител) и установления их линейности необходимо было выполнить постановку методики ИФА с использованием набора реагентов ИФА ГНЦ, используя в качестве антигена серию не менее 5 последовательных разведений разработанного СОП-1, По полученным данным построили графики зависимости lg ОП от log2

кратности разведения СОП-1, результаты представлены на рисунке 5.4.

Рисунок 5.4 – График зависимости отношения lg оптической плотности СОП-1 к log2 кратности его разведения (диапазон концентраций 0,8–0,001 АКЕ/мл) при использовании тест-

системы ИФА ЕИ

Из рисунка 5.4 видно, что линейная область в анализируемой тест-системе отмечается в диапазоне приблизительно от 0,0106 до 0,14 АКЕ/мл. Поэтому мы провели постановку методики ИФА с применением шести разведений СОП-1 в диапазоне концентраций 0,006-0,2 АКЕ/мл и повторно исследовали линейность.

При концентрации 0,1 АКЕ/мл и выше на графике наблюдается сначала плато кривой и это существенно занижает истинное значение. Поэтому мы повторно провели постановку методики ИФА с СОП-1 на пять разведений с шагом разведения в 2 раза от значения 0,1 АКЕ/мл и исследовали линейность в данном диапазоне калибровочной кривой тест-системы ИФА ЕИ.

Критерий приемлемости при оценке линейности: наличие линейности в зависимости отношения логарифма оптической плотности от логарифма кратности разведения образца (СОП-

1). Определение проводили с помощью статистического метода дисперсионного анализа,

который позволяет, с учетом всех экспериментальных погрешностей, определить наличие

119

линейности с необходимой доверительной вероятностью (коэффициент корреляции) не менее

0,99.

Из рисунка 5.5 и таблицы 5.11 видно, что отклонения фактических значений концентраций специфических антител для СОП-1 от номинальных значений при количественном определении антител к SARS-CoV-2 набором реагентов ИФА ЕИ в диапазоне концентрация СОП-1 от 0,006

до 0,2 АКЕ/мл не превышают 10%, на калибровочной кривой как минимум пять точек укладываются в диапазон исследования линейности тест-системы для определения концентрации антител к SARS-СоV-2 в ЛП ИГЧ против COVID-19, и полученные графики имеют коэффициенты корреляции более 0,99, что удовлетворяет критериям приемлемости.

Рисунок 5.5 - Калибровочный график зависимости отношения lg оптической плотности СОП-1 к уровню log2 кратности разведенияспецифической активности при количественном

определении антител к SARS-CoV-2 набором реагентов ИФА ЕИ

Параллелизм

Дополнительно были изучены линейность и параллелизм в соответствии с инструкцией по применению компьютерной программы «Паралайн», разработанной в ГИСКе им. Л.А.

Тарасевича (Табл. 5.12). В качестве калибратора использовали серию не менее 5

последовательных разведений разработанного СОП-1, в качестве исследуемых образцов - серию не менее 5 последовательных разведений препарата иммуноглобулина человека против COVID19. Результаты представлены на рисунке 5.6.

120

Таблица 5.11 – Отклонения фактических значений концентраций специфических антител для СОП-1, от номинальных значений, калибровочный график №1

По причине отсутствия коммерчески доступных стандартных образцов использовали

образцы 3 серий ЛП ИГЧ против COVID-19, не прошедших лиофильную сушку. Статистическую