12 Диссертация Смолянова

81

Таблица 4.9. – Изучение сходимости результатов определения концентрации антител к SARS- СоV-2 в плазме крови человека при определении аналитической области с использованием тест-системы ИФА ГНЦ (2 оператор, 2 день)

Таблица 4.10. – Изучение внутрилабораторной прецизионности результатов определения концентрации антител к SARS-СоV-2 в плазме крови человека при определении аналитической области с использованием тест-системы ИФА ГНЦ (2 оператора, 2 дня)

Параллелизм

Были изучены линейность и параллелизм в соответствии с инструкцией по применению компьютерной программы «Паралайн», разработанной в ГИСКе им. Л.А. Тарасевича (Табл. 4.11). Для этого были проведены измерения с использованием тест-системы ИФА ГНЦ. В

качестве калибратора использовали серию не менее 5 последовательных разведений разработанного СОП-ФС-1, в качестве исследуемых образцов - серию не менее 5

последовательных разведений плазмы для фракционирования. Результаты представлены на рисунке 4.5.

Для определения линейности и параллельности вычисляли суммы квадратов, связанные с каждым из этих параметров SS(ln), SS(pl), которые делили на соответствующие степени свободы

DF(ln), DF(pl), в результате чего получали средний квадрат этих величин MS(ln), MS(pl).

Одновременно вычисляли и сумма квадратов для величины остаточной ошибки SS(er), которую

82

затем делили на степень свободы DF(er), в результате чего получали величину среднего квадрата ошибки MS(er). Далее значения MS(ln) и MS(pl) сравнивали с величиной остаточной ошибки

MS(er), в результате чего получается значение так называемого параметра “F”. Величина этого параметра F-эксперим сравнивается с табличным значением F-теоретич с соответствующими степенями свободы. Если полученная экспериментальная величина больше, чем соответствующая величина в таблице, делается вывод о статистической значимости данного параметра (линейность, параллельность), в противном случае изменения, связанные с данным параметром, считаются статистически незначимыми. Результаты представлены в таблице 4.11.

Рисунок 4.5 – Изучение линейности и параллелизма методики количественного определения антител к SARS-CoV-2 с использованием тест-системы ИФА ГНЦ. Ряд 1 – СОП-

ФС-1, Ряд 2 – фармацевтическая субстанция, серия 1, Ряд 3 – фармацевтическая субстанция, серия 2, Ряд 4 – фармацевтическая субстанция, серия 3.

Таблица 4.11 - Изучение параметра параллелизм тест-системы ИФА ГНЦ с использованием программы «Паралайн»

83

параллельны друг другу, что соответствует критерию приемлемости. В результате проверки установлено, что основное условие выполнено и для любого испытуемого образца в пробе с использованием тест-системы ИФА ГНЦ прямая линия параллельна линии для стандартного образца.

4.2.2 Валидация методики определения концентрации антител к SARS-СоV-2 в

фармацевтической субстанции методом ИФА с использованием набора реагентов ИФА ЕИ.

Также работу по валидации методики определения концентрации антител к SARS-СоV-2

методом ИФА проводили для тест-системы ИФА ЕИ. Результаты представлены в таблицах 4.12- 4.20.

Оценка аналитической специфичности:

Оценка аналитической специфичности показывает способность аналитической методики однозначно оценивать определяемое вещество в присутствии сопутствующих компонентов. Так как в нашей работе была использована тест система, зарегистрированная как медицинское изделие, оценка перекрестной реактивности к другим видам коронавирусов была проведена производителем. По результатам испытаний образцов сыворотки (плазмы) крови пациентов,

имевших в анамнезе SARS-CoV-1, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, HCoVOC43, не показали наличие перекрёстной реактивности (количество положительных проб - 0%),

кроме SARS-CoV-1 (количество положительных проб - 20%).

Определение линейности

Для построения графиков зависимости уровня оптической плотности от специфической активности (концентрации вируснейтрализующих антител) и установления их линейности необходимо было выполнить постановку методики ИФА с использованием набора реагентов ИФА ЕИ, используя в качестве антигена калибратора серию не менее 5 последовательных разведений разработанного СОП-ФС-1, результаты представлены на рисунке 4.6.

Критерий приемлемости при оценке линейности: наличие линейности в зависимости отношения логарифма оптической плотности от логарифма кратности разведения образца (СОП-

ФС-1). Определение проводили с помощью статистического метода дисперсионного анализа,

который позволяет, с учетом всех экспериментальных погрешностей, определить наличие линейности с необходимой доверительной вероятностью (коэффициент корреляции) не менее

0,99 (Табл. 4.12 и 4.13).

85

Полученные графики имеют коэффициенты корреляции более 0,99, что удовлетворяет критериям приемлемости.

Определение прецизионности

Данная методика количественного определения специфической активности в плазме крови человека является оригинальной. При разработке оригинальной методики определяли повторяемость (сходимость) результатов, получаемых с ее использованием, и дополнительно определяли внутрилабораторную (промежуточную) прецизионность.

Данная методика количественного определения специфической активности в плазме крови человека является оригинальной, разработке оригинальной методики определяли повторяемость (сходимость) результатов, получаемых с ее использованием, и дополнительно определяли внутрилабораторную (промежуточную) прецизионность.

Сходимость

Сходимость исследовали на 6 однородных образцах оценивали в четырех повторностях.

Результаты оценки методики анализа по каждому из вариантов прецизионности обычно характеризуются соответствующим значением величины стандартного отклонения результата отдельного определения.

Рассчитывали среднее арифметическое значение, рассчитывали стандартное отклонение

(S.D.) и относительное стандартное отклонение (RSD).

Аналогичным образом провели статистическую обработку полученных результатов отдельно для операторов I и II (Табл. 4.14 и 4.15).

Полученные результаты расчета относительного стандартного отклонения для операторов

I и II составили 5,2-7,8 и 4,0-8,8, соответственно.

Таблица 4.14 - Изучение сходимости результатов определения концентрации антител к SARS- СоV-2 в фармацевтической субстанции с использованием тест-системы ИФА ЕИ

(1 оператор, 1 день)

86

Таблица 4.15 - Изучение сходимости результатов определения концентрации антител к SARS- СоV-2 в фармацевтической субстанции с использованием тест-системы ИФА ЕИ

(2 оператор, 2 день)

Таким образом, валидационное исследование повторяемости позволило сделать вывод о том, что для методики количественного определения специфической активности в плазме крови человека с использованием тест-системы ИФА ЕИ относительно стандартное отклонение для операторов I и II составили 5,2-7,8 и 4,0-8,8, (Табл. 4.14 и 4.15), что удовлетворяет критерию приемлемости – не должен превышать 20 %.

Определение внутрилабораторной прецизионности

Внутрилабораторную прецизионность оценивали по результатам постановки 6 однородных образцов в четырех повторностях, далее рассчитывали объединенное стандартное отклонение

(S.D.) и объединенное относительное стандартное отклонение (RSD).

Проведенные исследования внутрилабораторной прецизионности, позволили сделать вывод о том, что объединенное относительное стандартное отклонение внутрилабораторной прецизионности составило не более 9% (Табл. 4.16), что удовлетворяет критерию приемлемости

– не более 20 %.

Определение аналитической области

При определении аналитической области методики (интервала между верхним и нижним значением аналитических характеристик определяемого компонента в объекте анализа)

критерием приемлемости служили приемлемый уровень правильности и внутрилабораторной

(промежуточной) прецизионности.

К величине аналитической области методик предъявляются следующие требования:

– методики количественного определения должны быть применимы в интервале от 80 до

120 % от номинального значения определяемой аналитической характеристики;

Аналитическая область методики может быть установлена по диапазону экспериментальных данных, удовлетворяющих линейной модели.

87

Таблица 4.16 - Изучение внутрилабораторной прецизионности результатов определения концентрации антител к SARS-СоV-2 в плазме крови человека с использованием тест-системы ИФА ЕИ (2 оператора, 2 дня)

Таблица 4.17 - Изучение сходимости результатов определения концентрации антител к SARS- СоV-2 в фармацевтической субстанции при определении аналитической области с использованием тест-системы ИФА ЕИ (1 оператор, 1 день)

Таблица 4.18 - Изучение сходимости результатов определения концентрации антител к SARS- СоV-2 в фармацевтической субстанции при определении аналитической области с использованием тест-системы ИФА ЕИ (2 оператор, 2 день)

88

Таблица 4.19 - Изучение внутрилабораторной прецизионности результатов определения концентрации антител к SARS-СоV-2 в фармацевтической субстанции при определении аналитической области с использованием тест-системы ИФА ЕИ (2 оператора, 2 дня)

Таким образом, валидация методики количественного определения специфической активности методом ИФА с использованием набора реагентов ИФА ЕИ проведена на примере СОП-ФС-1. RSD при определении сходимости и точности - не более 20 %, коэффициент вариации при определении линейности – не менее 0,99. Аналитическая область находится в пределах 0,4 – 0,006 АКЕ/мл, RSD при определении сходимости и точности образцов с высоким и низким содержанием специфических антител (близко к LLOQ и ULOQ) - не более 25 %. Результаты,

полученные двумя исполнителями, сопоставимы и соответствуют критериям приемлемости.

Параллелизм

Были изучены линейность и параллелизм в соответствии с инструкцией по применению компьютерной программы «Паралайн», разработанной в ГИСКе им. Л.А. Тарасевича (Табл.

4.20).

Для этого были проведены измерения с использованием тест-системы ИФА ГНЦ В качестве калибратора использовали серию не менее 5 последовательных разведений разработанного СОП-ФС-1, в качестве исследуемых образцов - серию не менее 5

последовательных разведений плазмы для фракционирования. Для этого выли проведены измерения с использованием набора реагентов ИФА ЕИ, используя в качестве антигена серию не менее 5 последовательных разведений разработанного СОП-ФС-1 и серию не менее 5

последовательных разведений плазмы для фракционирования. Результаты представлены на рисунке 4.7.

89

Для определения линейности и параллельности вычисляли суммы квадратов, связанные с каждым из этих параметров SS(ln), SS(pl), которые делили на соответствующие степени свободы

DF(ln), DF(pl), в результате чего получали средний квадрат этих величин MS(ln), MS(pl).

Одновременно вычисляли и сумма квадратов для величины остаточной ошибки SS(er), которую затем делили на степень свободы DF(er), в результате чего получали величину среднего квадрата ошибки MS(er).

Рисунок 4.7 - Изучение линейности и параллелизма методики количественного определения антител к SARS-CoV-2 с использованием тест-системы ИФА ЕИ. Ряд 1 – СОП- ФС-1, Ряд 2 – фармацевтическая субстанция, серия 1, Ряд 3 – фармацевтическая субстанция,

серия 2, Ряд 4 – фармацевтическая субстанция, серия 3

Далее значения MS(ln) и MS(pl) сравнивали с величиной остаточной ошибки MS(er), в

результате чего получается значение так называемого параметра “F”. Величина этого параметра

(F-эксперим) сравнивается с табличным значением (F-теоретич) с соответствующими степенями

свободы. Величина этого параметра F сравнивается с табличным значением с соответствующими

степенями свободы. Если полученная экспериментальная величина больше, чем

соответствующая величина в таблице, делается вывод о статистической значимости данного

параметра (линейность, параллельность), в противном случае изменения, связанные с данным

параметром, считаются статистически незначимыми. Результаты представлены в таблице 4.20.

Врезультате было установлено, что зависимости логарифмов оптических плотностей от логарифма кратности разведения для исследуемых ЛП и СОП-ФС-1 линейны и эти линии параллельны друг другу, что соответствует критерию приемлемости.

Врезультате проверки установлено, что основное условие выполнено и для любого испытуемого образца в пробе с использованием набора реагентов ИФА ГНЦ прямая линия

параллельна линии для стандартного образца.

90

Таблица 4.20 - Изучение параллелизма для методики количественного определения специфической активности методом ИФА с использованием тест-системы ИФА ЕИ

Таким образом, валидационные характеристики метода ИФА с использованием тест-

систем двух производителей (ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ) позволяют сделать заключение о том, что его можно применять для количественного определении антител к SARS-СоV-2 в плазме крови человека.

4.3.Аттестация полученного СОП-ФС-1 с использованием референс-панели ВОЗ

NIBSC 20/268

На следующем этапе работ была проведена аттестация разработанного стандартного образца СОП-ФС-1 относительно референс-панели NIBSC 20/268, охарактеризованной в принятых ВОЗ единицах связывания BAU, с использованием наборов реагентов ИФА ГНЦ (48

проб), ИФА ЕИ (48 проб). Результаты представлены в таблицах 4.21-4.23.

По результатам статической обработки специфическая активность разработанного СОП-

ФС-1 была принята за 96,8±6,8 BAU/мл антител к SARS-СоV-2. Однако следует учесть, что международную референс-панель NIBSC 20/268 предлагается использовать для оценки и разработки тест-систем для обнаружения и количественного определения антител против SARS- CoV-2, панель состоит из 5 пулов плазмы (смесь 10 индивидуальных образцов),

охарактеризованных в международных единицах (МЕ/мл) и единицах связывания BAU (binding antibody units).