12 Диссертация Смолянова

71

Загрузка замороженного до температуры от минус 40 до минус 60 °С СОП-ФС-1 из низкотемпературной камеры в сублимационные установки производилась быстро при визуальном контроле с целью избежать его оттаивания. Кассеты с препаратом, закрытые колпаками, устанавливали на полки сублимационной установки, предварительно охлажденные до температуры не выше минус 20 °С. После герметизации аппарата из него откачивали воздух.

На всем протяжении процесса лиофилизации вакуум в сублиматоре не превышал 16,0 Па (60

мкА), а температура конденсатора не была выше минус 50 °С.

После достижения рабочих параметров сублимационной установки (температура конденсатора – не выше минус 50 °С, температура полок – не выше минус 20 оС, вакуум – не выше 16,0 Па (60 мкА)) задавался нагрев полок сублиматора до конечной температуры от 29 до

35 °С при средней скорости нагрева от 10 до 15 °С/час. Высушивание заканчивалось после выдержки флаконов с образцами не менее 2 ч при температуре от 29 до 35 °С и в плюсовом диапазоне температур не менее 16 ч. Режим сублимационного высушивания представлен на рисунке 4.2.

Рисунок 4.2 – Режим сублимационного высушивания образцов при приготовлении первичного стандартного образца предприятия для количественного определения антител к SARS-CoV-2 (СОП-ФС-1)

По окончании высушивания флаконов с образцами вакуум в сублимационной установке гасился стерильным воздухом, пропущенным через встроенный в сублиматор блок гашения вакуума, содержащий ватно-силикагелевый фильтр. Хранение флаконов с СОП-ФС-1 до герметизации осуществлялось в эксикаторных емкостях под вакуумом, глубина которого составляла от минус 0,8 до минус 1,0 кгс/см2. По окончании хранения вакуум в эксикаторе гасился стерильным воздухом, пропущенным через блок гашения вакуума.

72

Герметизацию флаконов (укупорку резиновыми пробками и фиксацию их алюминиевыми колпачками) проводили в боксовом помещении с помощью автомата укупорки и обкатки флаконов.

4.1.2. Оценка показателей качества первичного стандартного образца для

количественного определения антител к SARS-CoV-2 в фармацевтической субстанции

Была проведена оценка качества разработанного СОП-ФС-1 (Табл. 4.1).

СОП-ФС-1 был приготовлен из котловой загрузи плазмы, которая по всем показателям качества соответствовала ГФ РФ, ФС.3.3.2.0001.19 «Плазма человека для фракционирования».

Соответственно при оценке качества разработанного СОП-ФС-1 использовались параметры качества, в соответствии с ФС.3.3.2.0001.19, а также показатели качества лиофилизированных форм.

Таблица 4.1 - Основные характеристики качества разработанного первичного стандартного образца предприятия для количественного определения антител к SARS-CoV-2 (СОП-ФС-1)

73

соответствует требованиям показателей качества плазмы для фракционирования.

Первичный стандартный образец (СОП-ФС-1) был заложен на хранение при температуре минус 25 оС с целью дальнейшего использования для аттестации каждой новой серии вторичного

стандартного образца (СОП-ФС-2).

4.1.3. Определение количества антител к SARS-CoV-2 в СОП-ФС-1

Определение количества антител к SARS-CoV-2 в полученном СОП-ФС-1 проводили с

использованием референтного метода - РВН. В результате проведенных исследований было

установлено, что титр вируснейтрализующих антител в образце СОП-ФС-1 в 2-х лунках составил

1/20, в третьей – 1/40 (Табл. 4.2).

74

Таблица 4.2 - Результаты определения титра ВНА в стандартном образце предприятия для количественного определения антител к SARS-CoV-2 в плазме крови (СОП-ФС-1)

Для выражения уровня специфических антител в РВН использовался показатель титра ВНА, который представлял предельное разведение образца, при котором еще сохранялась вируснейтрализующая активность. Титр являлся удобной единицей выражения уровня специфических антител, однако не подходил при использовании в количественном ИФА. Соответственно использование СОП-ФС-1 для количественного определения уровня антител, специфичных к SARS-CoV-2, в фармацевтической субстанции для производства ЛП ИГЧ против

COVID-19 потребовало ввода единиц измерения, подходивших для использования в количественном ИФА. Была выбрана единица активности – антиковидная единица (АКЕ). За 1 единицу АКЕ образца была принята величина, обратная его разведению, обладающему способностью ингибировать появление на монослое культуры клеток Vero цитопатогенного действия SARS-CoV-2 в двух из трех лунок в реакции нейтрализации против 100 БОЕ вируса

SARS-CoV-2.

Таким образом, СОП-ФС-1 был охарактеризован по ВНА в установленных нами впервые единицах АКЕ. Соответственно, образцу был присвоен уровень специфической активности 20 антиковидных единиц/мл (AKE/мл).

4.2. Валидация методики количественного определения антител к SARS-СоV-2 в

фармацевтической субстанции методом ИФА с использованием наборов реагентов ИФА

ГНЦ и ИФА ЕИ

Полученный СОП-ФС-1 с охарактеризованным количественно показателем специфической активности позволил модифицировать тест системы ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ в количественные методики определения концентрации антител к SARS-СоV-2 с целью дальнейшего использования данных количественных методик для определения специфической активности в плазме для фракционирования, которая является фармацевтической субстанцией для производства иммуноглобулина против COVID-19, а также для аттестации новых серий вторичных контрольных образцов (СОП-ФС-2).

75

Валидацию методики определения концентрации антител к SARS-СоV-2 методом ИФА тест системами ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ проводили по перечисленным ниже характеристикам:

•аналитической специфичности (specificity);

•аналитической области (range);

•линейности (linearity);

•правильности (trueness);

•прецизионности (precision): повторяемости (сходимости) и промежуточной

(внутрилабораторной) прецизионности.

Валидацию методики проводили двумя операторами в течение двух дней в двух повторностях с использованием разработанного СОП-ФС-1 и трех серий плазмы. Для полученных значений уровней специфических антител (АКЕ/мл) были рассчитаны величины:

среднее значение, стандартное и относительное стандартное отклонения (RSD, %).

4.2.1. Валидация методики определения концентрации антител к SARS-СоV-2

методом ИФА с использованием тест-системы ИФА ГНЦ

В рамках данной работы проводили валидацию методики определения концентрации антител к SARS-СоV-2 методом ИФА с использованием тест-системы ИФА ГНЦ в фармацевтической субстанции. Результаты представлены в таблицах 4.3-4.11.

Оценка аналитической специфичности:

Оценка аналитической специфичности показывает способность аналитической методики однозначно оценивать определяемое вещество в присутствии сопутствующих компонентов. Так как в нашей работе была использована тест система, зарегистрированная как медицинское изделие, оценка перекрестной реактивности была проведена производителем. По данным производителя по результатам испытаний образцов сыворотки (плазмы) крови пациентов,

имевших в анамнезе другие типы коронавируса, HBV, HCV, HIV-1, HIV-2, Adenovirus, Human Metapneumovirus (hMPV) , Parainfluenza virus 1-4, Influenza A, Influenza B, Enterovirus 71, Respiratory syncytial virus, Rhinovirus, Chlamydia pneumoniae , Streptococcus pneumonia, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, EBV ни одна из испытанных проб не показала наличие перекрестной реактивности.

Определение линейности:

Для построения графиков зависимости уровня оптической плотности от специфической активности (концентрации вируснейтрализующих антител) и установления их линейности необходимо было выполнить постановку методики ИФА с использованием тест-системы ИФА

76

ГНЦ, используя в качестве калибратора серию не менее 5 последовательных разведений разработанного СОП-ФС-1. СОП-ФС-1 был разведен до концентрации 3,2–0,003 АКЕ/мл. По полученным данным был построен график зависимости оптической плотности от концентрации специфических антител (кратности разведения образца) в двойных логарифмических координатах (Рис. 4.3).

Рисунок 4.3 - График зависимости отношения lg оптической плотности образца к log2 кратности его разведения (диапазон концентраций 3,2–0,003 АКЕ/мл) при использовании тест-

системы ИФА ГНЦ

Из графика, видно, что эта зависимость носит нелинейный характер, а коэффициент корреляции не соответствует критерию приемлемости (r ≥ 0,99). По графику был проведен обратный расчет концентраций калибровочных стандартов и рассчитаны их отклонения от номинальных значений. На основании полученных данных был выбран линейный участок графика (Рис. 4.4).

При анализе полученных результатов повторная постановка была проведена в более узком диапазоне разведений СОП-ФС-1, от 0,012- 0,4 АКЕ/мл. По полученным данным был построен график зависимости оптической плотности от кратности разведения образца (концентрации специфических антител) в двойных логарифмических координатах (Рис. 4.4).

Критерий приемлемости при оценке линейности: наличие линейности в зависимости отношения логарифма оптической плотности от логарифма кратности разведения образца (СОП-

ФС-1). Определение проводили с помощью статистического метода дисперсионного анализа,

который позволяет, с учетом всех экспериментальных погрешностей, определить наличие линейности с необходимой доверительной вероятностью (коэффициент корреляции) не менее

0,99 (Табл. 4.3 и 4.4).

Полученные графики имеют коэффициенты корреляции более 0,99, что удовлетворяет критериям приемлемости.

78

Определение прецизионности

Данная методика количественного определения специфической активности в плазме крови человека является оригинальной. При разработке оригинальной методики определяли повторяемость (сходимость) результатов, получаемых с ее использованием, и дополнительно определяли внутрилабораторную (промежуточную) прецизионность.

Сходимость

Сходимость исследовали на 6 однородных образцах оценивали в четырех повторностях.

Результаты оценки методики анализа по каждому из вариантов прецизионности обычно характеризуются соответствующим значением величины стандартного отклонения результата отдельного определения.

Рассчитывали среднее арифметическое значение, рассчитывали стандартное отклонение

(S.D.) и относительное стандартное отклонение (RSD) в соответствии с ОФС «Статистическая обработка результатов химического эксперимента».

Аналогичным образом провели статистическую обработку полученных результатов отдельно для операторов I и II (Табл. 4.5 и 4.6).

Полученные результаты расчета относительного стандартного отклонения для операторов

I и II составили 11,4-13,2 и 3,5-5,3, соответственно.

Таким образом, валидационное исследование повторяемости позволило сделать вывод о том, что для методики количественного определения специфической активности в плазме крови человека с использованием тест-системы ИФА ГНЦ относительно стандартное отклонение для операторов I и II составили 11,4-13,2 и 3,5-5,3 (Табл. 4.5 и 4.6), что удовлетворяет критерию приемлемости – не должен превышать 20 %.

Таблица 4.5 – Изучение сходимости результатов определения концентрации антител к SARS- СоV-2 в фармацевтической субстанции с использованием тест-системы ИФА ГНЦ (1 оператор, 1 день)

79

Таблица 4.6 – Изучение сходимости результатов определения концентрации антител к SARS- СоV-2 в фармацевтической субстанции с использованием тест-системы ИФА ГНЦ (2 оператор, 2 день)

Внутрилабораторная прецизионность

Внутрилабораторную прецизионность оценивали по результатам постановки 6

однородных образцов в четырех повторностях, далее рассчитывали объединенное стандартное отклонение (S.D.) и объединенное относительное стандартное отклонение (RSD).

Проведенные исследования внутрилабораторной прецизионности, позволили сделать вывод о том, что объединенное относительное стандартное отклонение внутрилабораторной прецизионности составило не более 17,9% (Табл. 4.7), что удовлетворяет критерию приемлемости – не более 20 %.

Определение аналитической области

При определении аналитической области методики (интервала между верхним и нижним значением аналитических характеристик определяемого компонента в объекте анализа)

критерием приемлемости служили приемлемый уровень правильности и внутрилабораторной

(промежуточной) прецизионности.

К величине аналитической области методик предъявляются следующие требования:

– методики количественного определения должны быть применимы в интервале от 80 до

120 % от номинального значения определяемой аналитической характеристики.

Аналитическая область методики может быть установлена по диапазону экспериментальных данных, удовлетворяющих линейной модели.

80

Таблица 4.7 – Изучение внутрилабораторной прецизионности результатов определения концентрации антител к SARS-СоV-2 в плазме крови человека с использованием тест-системы ИФА ГНЦ (2 оператора, 2 дня)

Валидация методики количественного определения специфической активности методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-системы ИФА ГНЦ, проведенная с СОП-ФС-1, показала, что специфическая активность плазмы составила не менее 20 АКЕ/мл, RSD

при определении сходимости и точности - не более 20 %, коэффициент вариации при определении линейности – не менее 0,99. Аналитическая область находится в пределах 0,4 – 0,006 АКЕ/мл, RSD при определении сходимости и точности образцов с высоким и низким содержанием специфических антител (близко к LLOQ и ULOQ) - не более 25 % (Табл. 4.8.- 4.10).

Результаты, полученные двумя исполнителями, сопоставимы и соответствуют критериям приемлемости.

Таблица 4.8 – Изучение сходимости результатов определения концентрации антител к SARS- СоV-2 в плазме крови человека при определении аналитической области с использованием тест-системы ИФА ГНЦ (1 оператор, 1 день)