12 Диссертация Смолянова

131

Таблица 5.24 - Определение коэффициента пересчета антиковидных единиц (АКЕ/мл) в международные единицы связывания (BAU/мл)

5.4. Изучение стабильности первичного стандартного образца количественного

определения антител к SARS-CoV-2 в лекарственном препарате иммуноглобулина против

COVID-19

Стабильность стандартных и контрольных образцов является одной из их важнейших характеристик. В соответствии с рекомендациями ВОЗ для оценки стабильности используют ускоренный тест на термостабильность, позволяющий по результатам сравнительно короткого испытания при повышенных температурах прогнозировать активность и срок годности образца при температуре его хранения.

При исследовании стабильности методом «ускоренного старения» определяли зависимость изменения активности СОП-1 от срока хранения при повышенной температуре. При этом повышенную температуру выбрали экспериментально таким образом, чтобы в течение периода измерения наблюдалось статистически значимое падение активности.

Температура хранения стандартного образца (Тхр) составляет –20 оС. Для исследования стабильности методом «ускоренного старения» выбрали несколько температурных значений (+5,

+20, +37, +56 оС), при которых в течение периода наблюдения определяли уровень антител к

SARS-CoV-2 и определяли экспериментальный срок годности (Сэ), при котором не происходит достоверного падения специфической активности.

Срок годности (С) при температуре хранения (Тхр) связан с экспериментальным сроком годности (Сэ) при повышенной температуре экспериментального хранения (Тэ) следующей зависимостью: С=К*Сэ, где коэффициент соответствия К=А(Тэ-Тхр)/10. Температурный коэффициент скорости химической реакции (A) принят равным 2,5.

С целью изучения стабильности и установления срока годности СОП-1 для определения специфической активности была использована серия СОП-1 в количестве 48 флаконов.

132

Образцы СОП-1 закладывали на хранение при температурах 5, 20, 37 и 56о и далее анализировали на 2, 10, 54 и 84 сутки от закладки. Анализ проводили по параметру специфическая активность.

Для определения предполагаемого срока хранения использовали значения экспериментального срока годности эксперимента (Сэ) для каждой температуры хранения, на котором не происходит падения значения параметра специфической активности. Данные с учетом результатов расчета по приведенной выше формуле представлены в таблице 5.25.

Таблица 5.25 - Предполагаемый срок хранения стандартного образца СОП-1, установленный методом «ускоренного старения»

Таким образом, предполагаемый срок хранения стандартного образца, установленный методом «ускоренного старения», составляет 5 лет. Наблюдения продолжаются.

5.5. Получение вторичного стандартного образца для количественного

определения антител к SARS-CoV-2

Для рутинного использования в выпускающем контроле качества при производстве ЛП ИГЧ против COVID-19, предполагающей большое количество исследований, была произведена серия вторичного стандартного образца для количественного определения антител к SARS-CoV- 2 (СОП-2) по той же схеме, что и первичного стандартного образца СОП-1. Для обеспечения стабильности физико-химических и биологических свойств СОП-2 были использованы сахароза в конечной концентрации 28 %, стерильный розлив по 0,1 мл во флаконы, лиофильное высушивание, герметизация флаконов (аналогично п. 5.1.1.). При получении СОП-2 первым этапом работ был проведен анализ основных характеристик качества в соответствии с требованиями к соответствующим показателям качества СОП-1 и требованиями к соответствующим показателям качества препаратов иммуноглобулинов, аналогично п 5.1.1.

133

Было установлено, что значение показателей качества разработанного СОП-2

соответствует показателям качества СОП-1 и требованиям к соответствующим показателям качества препаратов иммуноглобулинов.

На следующем этапе работ было проведено установление специфической активности СОП-2 в АКЕ/мл методом ИФА с использованием наборов реагентов ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ в модификации для количественного определения с использованием СОП-1 в качестве калибратора.

Работы проводились тремя операторами в течение двух дней в двух повторностях с использованием наборов реагентов ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ. Для полученных значений уровней специфических антител (АКЕ/мл) были рассчитаны величины: среднее значение, стандартное и относительное стандартное отклонения (RSD, %). Результаты представлены в таблицах 5.26 и

5.27.

Для значения концентраций антител к SARS-CoV-2 (показателя специфической активности) в СОП-2, полученные с использованием наборов реагентов ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ,

рассчитывали по формулам согласно ОФС.1.1.0013.15 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента» показатели: среднее значение, стандартное и относительное стандартное отклонения, а также значение доверительного интервала (Табл. 5.28).

По результатам статической обработки результатов аттестации специфическая активность СОП-2 была принята за 200 АКЕ/мл.

Таблица 5.26 - Определение специфической активности СОП-2 с использованием набора реагентов ИФА ЕИ

134

Таблица 5.27 - Определение специфической активности СОП-2 с использованием набора реагентов ИФА ГНЦ

Таблица 5.28 - Оценка аттестованного значения специфической активности СОП и характеристики неопределенности аттестованного значения

Линейность и параллелизм были изучены с использованием тест-систем ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ в серии не менее пяти последовательных разведений СОП-1 и СОП-2 в соответствии с инструкцией по применению компьютерной программы «Паралайн», разработанной в ГИСКе им. Л.А. Тарасевича. Результаты представлены в таблицах 5.29 и 5.30 и на рисунках 5.7 и 5.8.

Таблица 5.29 - Изучение параллелизма при определении показателя специфической активности в СОП-2 относительно СОП-1 с использованием набора реагентов ИФА ГНЦ

Таблица 5.30 - Изучение параллелизма при определении показателя специфической активности в СОП-2 относительно СОП-1 с использованием набора реагентов ИФА ЕИ

136

5.6. Применение разработанных первичного и вторичного стандартных образцов

для количественного определения антител к SARS-CoV-2

Разработанный первичный стандартный образец для количественного определения антител к SARS-CoV-2 в ЛП ИГЧ против COVID-19 (СОП-1) применяется для количественного определения уровня специфической активности СОП-2, выраженного в АКЕ/мл или BAU/мл.

Разработанный СОП-2 применяется для количественной оценки и выражения в АКЕ/мл или BAU/мл антител против SARS-CoV-2, содержащихся в конечном и промежуточных продуктах на различных стадиях технологического процесса получения ЛП ИГЧ против COVID-

19, методом ИФА с использованием тест-систем ИФА ГНЦ и ИФА ИЕИ. Определена специфическая активность ЛП ИГЧ против COVID-19, составляющая не менее 160 АКЕ/мл.

Показатель «Специфическая активность» внесен в НД на лекарственный препарат,

Иммуноглобулин человека против COVID-19 раствор для инфузий, 100 мг/мл «КОВИД-

глобулин».

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 5

1. Разработан стандартный образец для количественного определения антител к SARS- CoV-2 в лекарственном препарате иммуноглобулина человека против COVID-19 (СОП-1),

идентичный по свойствам, составу и происхождению исследуемым образцам.

2.Проведена аттестация разработанного СОП-1 референтным методом РВН. Титр вируснейтрализующих антител, соответствующий 1:320, позволил присвоить СОП-1 значение активности в установленных впервые единицах измерения (антиковидные единицы), равное 320 AKE/мл.

3.Разработана методика количественного определения антител к SARS-CoV-2 методом ИФА с использованием СОП-1 и наборов реагентов ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ. Валидационные характеристики разработанной методики позволяют сделать заключение о том, что методика применима для определения антител к SARS-СоV-2 в лекарственном препарате иммуноглобулина человека против COVID-19.

4.Выполнены исследования по сравнительной оценке содержания антител к

SARS-CoV-2 в СОП-1, выраженного в единицах активности АКЕ/мл, относительно референс-

панели NIBSC 20/268, охарактеризованной в принятых ВОЗ единицах связывания BAU/мл.

Установлено, что специфическая активность СОП-1 составила 2234,8±158,8 BAU/мл антител к

SARS-СоV-2. Коэффициент пересчета АКЕ/мл в BAU/мл составил 6,4 для набора реагентов ИФА ГНЦ, 7,0 для набора реагентов ИФА ЕИ.

5. Предполагаемый срок хранения СОП-1, установленный методом «ускоренного старения», составляет 5,7 лет.

137

6. С использованием СОП-2 проведено более 100 исследований образцов ЛП ИГЧ против COVID-19 по показателю специфическая активность, выраженному в АКЕ/мл, методом ИФА с использованием тест-систем ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ. Показатель «Специфическая активность» внесен в НД на лекарственный препарат, Иммуноглобулин человека против COVID-

19 раствор для инфузий, 100 мг/мл «КОВИД-глобулин». Определена специфическая активность ЛП ИГЧ против COVID-19, составляющая не менее 160 АКЕ/мл.

138

ГЛАВА 6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РАЗРАБОТАННОЙ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРИ ИЗУЧЕНИИ ФАРМАКОКИНЕТИКИ

ИММУНОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА ПРОТИВ COVID-19

Сцелью получения дополнительной информации о свойствах ЛП ИГЧ против COVID-19

врамках I фазы клинического исследования было принято решение исследования фармакокинетических параметров при проведении инфузии препарата здоровым добровольцам

[170-172].

Было проведено изучение фармакокинетики препарата КОВИД-глобулин при однократном внутривенном введении в дозе 4 мл/кг с участием здоровых добровольцев.

Количественное определение концентраций антител против SARS-CoV-2 проводилось методом ИФА с использованием набора реагентов ИФА ГНЦ. В качестве калибратора разработанный СОП-2, разведенный пулированной интактной плазмой крови человека [173-174].

6.1. Изучение селективности ИФА ГНЦ

Дополнительно к валидационным характеристикам, определенным в главе 5, для исследования уровня специфической активности в образцах здоровых добровольцев с использованием тест-системы ИФА ГНЦ был исследован параметр селективность.

Селективность подтверждалась с использованием 10 образцов индивидуальной интактной плазмы крови (образцов здоровых доноров, собранных до начала пандемии COVID-19), включая гиперлипидемические и гемолизированные образцы, и образцов интактной плазмы крови с добавлением антител к SARS-CoV-2 до уровня нижнего предела количественного определения,

соответствующего 0,00625 АКЕ/мл (НПКО). Каждый из образцов анализировали в трех повторах. Было показано, что ОП образцов интактной плазмы не превышает значений ОП образцов с содержанием антител к SARS-CoV-2 на уровне НПКО. Для оценки селективности методики рассчитывались значения относительной погрешности для каждого из образцов.

Полученные значения соответствовали требованиям нормативной документации (относительная погрешность не менее 80% образцов с содержанием антител к SARS-CoV-2 на уровне НПКО должна составлять не более ±25%). По результатам относительная погрешность 100% образцов с содержанием антител к SARS-CoV-2 на уровне НПКО составила не более 25%. Данные,

полученные при оценке селективности, и рассчитанные значения относительной погрешности приведены в таблице 6.1.

Таким образом, валидационные характеристики методики количественного определения уровня специфической активности с использованием тест-системы ИФА ГНЦ, включая параметр селективность, позволяют применять данную методику для оценки фармакокинетических параметров препарата иммуноглобулина против COVID-19.

139

Таблица 6.1 - Селективность методики количественного определения антител к SARS-CoV-2 в плазме крови

6.2. Исследование фармакокинетических параметров препарата иммуноглобулина

против COVID-19

Было проведено изучение фармакокинетики препарата КОВИД-глобулин при однократном внутривенном введении в дозе 4 мл/кг с участием здоровых добровольцев.

Разработанный стандартный образец применялся как контрольный образец при изучении количества антител к SARS-CoV-2 в сыворотке крови добровольцев.

В исследовании принимали участие 24 здоровых добровольца в возрасте 18-60 лет.

Фармакокинетические параметры исследуемого препарата КОВИД-глобулин были рассчитаны для двух серий: серию П3 (содержание антител к SARS-CoV-2 – 330 АКЕ/мл) вводили 8

добровольцам, серию П4 (содержание антител к SARS-CoV-2 – 250 АКЕ/мл) вводили 16

добровольцам.

140

Для облегчения процедуры проведения инфузии исследуемого препарата и отбора проб крови для фармакокинетического исследования, а также уменьшения дискомфорта добровольца

водну из локтевых вен в первые сутки перед началом инфузии был установлен кубитальный катетер. Далее катетер удаляется не позже, чем через 24 часа после окончания введения препарата. Препарат КОВИД-глобулин вводили внутривенно капельно в дозе 4 мл/кг однократно. Начальная скорость введения препарата – от 0,01 до 0,02 мл/кг массы тела в минуту

втечение 30 мин. Если препарат хорошо переносился, скорость введения постепенно увеличивалась максимально до 0,12 мл/кг массы тела в минуту. С целью контроля скорости введения препарата инфузия проводится при помощи инфузионного насоса. У каждого добровольца отбиралось 11 проб крови для изучения фармакокинетики: перед введением препарата (-0,25 часа), через 0,25, 6, 12, 24 и 48 часов, через 4, 8, 12, 16, 21 сутки после окончания введения препарата.

Далее образцы крови отбирались в обработанные ЭДТА пробирки типа «Vacutainer»,

центрифугировались в течение 10 минут при скорости 3000 об/мин. Полученную плазму разделили на 2 равные аликвоты: основную и контрольную. Основные аликвоты плазмы замораживали, хранили и транспортировали в аналитическую лабораторию при температуре не выше минус 20 °С до проведения анализа.

Концентрацию антител против SARS-CoV-2 в исследуемых образцах определяли непосредственно по калибровочной кривой.

Индивидуальные профили изменения значений концентраций антител к вирусу SARS- CoV-2 в плазме крови добровольцев во времени, зарегистрированные после введения исследуемого препарата КОВИД-глобулин, характеризовались максимальным значением концентраций специфических антител IgG к вирусу SARS-CoV-2 ЛП (Сmax) и временем его достижения (Tmax), площадью под кривой «концентрация специфических антител IgG к вирусу

SARS-CoV-2 – время» с момента введения до последнего определяемого значения концентрации специфических антител IgG к вирусу SARS-CoV-2 во временной точке t (AUC0-t), рассчитанной методом трапеций, площадью под кривой «концентрация специфических антител IgG к вирусу

SARS-CoV-2 – время» с момента введения препарата до бесконечности (AUC0-∞). Дополнительно определялись следующие фармакокинетические параметры: период полувыведения специфических антител IgG к вирусу SARS-CoV-2 (T1/2), константа скорости элиминации (Kel),

оцениваемая по угловому коэффициенту линии регрессии, рассчитанного по методу наименьших квадратов, натурального логарифмического значения концентраций специфических антител IgG

к вирусу SARS-CoV-2 по отношению ко времени получения последних значений концентраций специфических антител IgG к вирусу SARS-CoV-2 свыше нижнего предела количественного определения, объем распределения ЛП (Vd).