12 Диссертация Смолянова

51

Т – концентрация антител в исследуемом образце, АКЕ/мл;

коэффициент 0,2 - концентрация антител Основного разведения СОП (0,2АКЕ/мл);

А – кратность разведения СОП;

В – разведение ИО (исследуемого образца), взятое в расчет Вычисляли среднюю арифметическую концентрацию специфических антител в

разведениях исследуемого образца.

2.2.Изучение фармакокинетики препарата КОВИД-глобулин

Количественное определение концентраций антител против SARS-CoV-2 проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием спектрофотометрического детектирования в видимом диапазоне спектра на автоматическом планшетном иммуноферментном анализаторе «Lazurite» (Dynex Technologies, Inc, США). Для построения калибровочной кривой (график зависимости оптической плотности от концентрации антител против SARS-CoV-2) использовали контрольный образец, разведенный пулированной интактной плазмой крови человека. Концентрацию антител против SARS-CoV-2 в исследуемых образцах определяли непосредственно по этой кривой. В ходе проведения аналитической части исследования использовали набор реагентов Anti-SARS-CoV-2 ELISA (IgG) (Euroimmun AG,

Германия).

Фармакокинетические параметры исследуемого препарата КОВИД-глобулин рассчитывали для двух серий: серию П3 (содержание антител к SARS-CoV-2 – 330 АКЕ/мл)

вводили 8 добровольцам, серию П4 (содержание антител к SARS-CoV-2 – 250 АКЕ/мл) вводили

16 добровольцам.

Для облегчения процедуры проведения инфузии исследуемого препарата и отбора проб крови для фармакокинетического исследования, а также уменьшения дискомфорта добровольца,

водну из локтевых вен в первые сутки перед началом инфузии был установлен кубитальный катетер. Далее катетер удаляется не позже, чем через 24 часа после окончания введения препарата. Препарат КОВИД-глобулин вводили внутривенно капельно в дозе 4 мл/кг однократно. Начальная скорость введения препарата – от 0,01 до 0,02 мл/кг массы тела в минуту

втечение 30 мин. Если препарат хорошо переносился, скорость введения постепенно увеличивалась максимально до 0,12 мл/кг массы тела в минуту. С целью контроля скорости введения препарата инфузия проводится при помощи инфузионного насоса. У каждого добровольца отбиралось 11 проб крови для изучения фармакокинетики: перед введением препарата (-0,25 часа), через 0,25, 6, 12, 24 и 48 часов, через 4, 8, 12, 16, 21 сутки после окончания введения препарата.

52

Далее образцы крови отбирались в обработанные ЭДТА пробирки типа «Vacutainer»,

центрифугировались в течение 10 минут при скорости 3000 об/мин. Полученная плазма разделялась на 2 равные аликвоты: основную и контрольную. Основные аликвоты плазмы замораживали, хранили и транспортировали в аналитическую лабораторию при температуре не выше минус 20 °С.

Индивидуальные профили изменения значений концентраций специфических антител

IgG к вирусу SARS-CoV-2 в плазме крови добровольцев во времени, зарегистрированные после введения исследуемого препарата КОВИД-глобулин, характеризовали максимальным значением концентраций специфических антител IgG к вирусу SARS-CoV-2 лекарственного средства (Сmax)

и временем его достижения (Tmax), площадью под кривой «концентрация специфических антител

IgG к вирусу SARS-CoV-2 – время» с момента введения до последнего определяемого значения концентрации специфических антител IgG к вирусу SARS-CoV-2 во временной точке t (AUC0-t),

рассчитанной методом трапеций, площадью под кривой «концентрация специфических антител

IgG к вирусу SARS-CoV-2 – время» с момента введения препарата до бесконечности (AUC0-∞).

Дополнительно определяли следующие фармакокинетические параметры: период полувыведения специфических антител IgG к вирусу SARS-CoV-2 (T1/2), константа скорости элиминации (Kel), оцениваемая по угловому коэффициенту линии регрессии, рассчитанного по методу наименьших квадратов, натурального логарифмического значения концентраций специфических антител IgG к вирусу SARS-CoV-2 по отношению ко времени получения последних значений концентраций специфических антител IgG к вирусу SARS-CoV-2 свыше нижнего предела количественного определения, объем распределения лекарственного средства

(Vd).

Расчет фармакокинетических параметров проводили с помощью пакета Microsoft Excel с

расширением для проведения фармакокинетического анализа Boomer (Department of Pharmacokinetics and Drug Metabolism Allergan, Irvine, CA 92606, США). Распределение фармакокинетических параметров описано мерами центральной тенденции (среднее арифметическое, среднее геометрическое, медиана) и мерой разброса данных (стандартное отклонение, коэффициент вариации, минимальное значение, максимальное значение).

Описательную статистику фармакокинетических параметров проводили с помощью Microsoft

Excel (Microsoft Corporation, США).

2.3. Статистические методы

Статистическую обработку результатов исследований проводили в соответствии с ОФС.1.1.0013.15 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента» с

помощью компьютерных программ Microsoft Excel и GraphPad Prism 8.0 [160].

53

В настоящем исследовании экспериментальные величины представлены в виде: среднего арифметического значения (х) и стандартного отклонения (Sх).

Для определения нормальности распределения данных использовали тесты Д’Агостино-

Пирсона, Шапиро-Уилка и Колмогорова-Смирнова на нормальность распределения [161].

Для выявления взаимосвязей между результатами исследования, полученными в ИФА и РВН использовали, метод корреляционного анализа по Спирмену [162].

Статистическую оценку достоверности различий результатов исследований проводили с применением параметрических критериев однофакторного дисперсного анализа [163].

Стандартное отклонение (Sr) рассчитывали как корень квадратный из общей средней

дисперсии повторяемости по формуле:

Коэффициент вариации прецизионности/повторяемости (CV) рассчитывали по формуле:

где σR/r – стандартное отклонение прецизионности/повторяемости.

Выборочное стандартное отклонение внутрилабораторной прецизионности (SR)

рассчитывали по формуле:

где: L – число результатов измерений в условиях промежуточной прецизионности; n – число результатов измерений в условиях повторяемости;

N=nL – число всех результатов измерений.

Диапазон аттестуемых значений (ΔX) со степенью достоверности 95 % вычисляли по формуле: ΔX= ± 2Sх.

54

ГЛАВА 3. ВЫБОР МЕТОДА ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ АНТИТЕЛ К SARS-COV-2 В

ОБРАЗЦАХ ПЛАЗМЫ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ ИММУНОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА ПРОТИВ COVID-19

3.1 Разработка научно-методических подходов к выбору метода определения специфической активности противовирусных иммуноглобулинов

Одним из важнейших показателей, определяющих качество ЛП специфических противовирусных ИГЧ, является показатель специфической активности, который характеризуется содержанием антител, нейтрализующих вирус.

Для определения специфической активности используют ограниченный набор методов.

Анализ литературных данных позволил определить, что одним из основных традиционных методов определения титра специфической активности лекарственных препаратов противовирусных иммуноглобулинов является РВН. Так как данный метод используется для определения специфической активности в лекарственном препарате, целесообразно этот же метод использовать для определения содержания действующего вещества в сырье. Однако данный метод является достаточно трудоемким, что не позволяет применять метод определения титра ВНА массово. Что заведомо может привести к ограничению сырьевой базы.

Также для определения специфической активности установлена тенденция перехода на методы in vitro, так как они имеют значительные преимущества такие как низкая стоимость,

дешевизна и более высокая точность.

Таким образом, в начале работ было целесообразно разработать схему научно-

методических подходов к выбору метода определения специфической активности противовирусных иммуноглобулинов со стратегией, учитывающей возможность замены сложного референтного метода на более приемлемый в рутинной практике метод.

Такие подходы позволят использовать простой метод для рутинного контроля образцов плазмы, что позволит применять методику при заготовке плазмы для фракционирования, что может значительно расширить сырьевую базу. Также возможность использования одного и того же метода для контроля сырья и ЛП обеспечит сквозную стандартизацию при производстве.

Анализ литературных данных и использование озвученных выше принципов позволило осуществить разработку научно-методических подходов к выбору метода определения специфической активности противовирусных иммуноглобулинов, изображенных на рисунке 3.1.

55

Риc. 3.1. – Схема научно-методических подходов к выбору метода определения специфической активности противовирусных иммуноглобулинов

56

В специфическом противовирусном ЛП ИГЧ против COVID-19 действующим веществом являются иммуноглобулины класса G, обладающие ВНА по отношению к вирусу SARS-CoV-2.

Соответственно, для разработки и производства ЛП ИГЧ против COVID-19 для требуется плазма,

протестированная на наличие маркеров инфекций, передающихся с кровью, соответствующая показателям качества ФС.3.3.2.0001.19 «Плазма человека для фракционирования» и содержащая необходимое количество антител к SARS-CoV-2 [164].

Применительно к SARS-CoV-2 в соответствии с разработанной схемой научно-

методических подходов к выбору метода определения специфической активности было установлено, что референтным методом является РВН. РВН представляет из себя достаточно трудоемкий и сложный метод, требующий наличия специальной лаборатории, обладающей соответствующей лицензией на работу с патогенами II группы и, конкретно, с вирусом

SARS-CoV-2. Это не позволяет применять метод определения титра ВНА массово, поэтому целесообразно оценить возможность использования другого, более доступного метода. Таким образом, в соответствии с разработанной схемой научно-методических подходов к выбору метода определения специфической активности противовирусных иммуноглобулинов наиболее подходящим для этих целей представляется метод ИФА достаточной чувствительности и специфичности.

В связи с этим установлено, что данный метод не применим для рутинного производства ЛП ИГЧ против COVID-19. Таким образом возикла необходимость выбора унифицированного количественного иммуноферментного метода определения антител, характеризующегося информативностью и приемлемой корреляцией с РВН, простотой, минимальными затратами времени и удовлетворительной прецизионностью.

С момента официальной регистрации вспышки COVID-19, вызванной SARS-CoV-2, стали доступны многочисленные тест-системы ИФА, предназначенные для определения специфических антител и демонстрирующие как разные аналитические характеристики, так и разные способы оценки уровня специфических антител в образцах. Поэтому целесообразно было применить разработанные научно-методические подходы с использованием коммерчески доступных ИФА тест-систем.

3.2 Исследование образцов лекарственных препаратов Иммуноглобулина человека нормального на содержание вируснейтрализующих антител, специфичных к

SARS-CoV-2, в РВН и методом ИФА

На первом этапе исследования нами была проведена проверка гипотезы, что иммунитет к сезонным коронавирусам может также иметь кроссреактивность к SARS-CoV-2. Особенностью ЛП ИГЧ нормального является то, что для производства одной серии ЛП используется пул из

1000 донаций и, таким образом, препарат можно считать усредненным профилем

57

иммуноглобулинов в популяции. По литературным данным около 15% сезонных ОРВИ ежегодно вызваны коронавирусами [165]. В таком случае, в ЛП ИГЧ нормального могут быть выявлены антитела к сезонным коронавирусам, и кроссреактивность к SARS-CoV-2 у данных антител может быть доказана наличием ВНА в РВН.

Для проверки данной гипотезы 72 серии ЛП ИГЧ нормального, произведенные в 2019-

2020 годах до вспышки COVID-19, были исследованы методом ИФА в тест-системах разных производителей и в РВН.

Результаты исследования по определению содержания антител к SARS-CoV-2 в

препаратах иммуноглобулина человека нормального с использованием наборов реагентов различных производителей приведены в таблице 3.1.

Таблица 3.1 – Результаты определения содержания антител, специфичных к SARS-CoV-2, и вируснейтрализующих антител в РВН в лекарственных препаратах иммуноглобулина человека нормального

59

Данное неспецифическое взаимодействие, возможно, объясняется тем, что наборы реагентов предназначены для определения содержания антител к SARS-CoV-2 в сыворотках

(плазме) крови человека, а не в препаратах иммуноглобулинов.

Полученные данные позволяют сделать несколько выводов:

1) В препаратах иммуноглобулинов человека нормального возможно содержание иммуноглобулинов IgG, специфичных к SARS-CoV-2, определенных методом ИФА в тест-

системах разных производителей.

2) В препаратах иммуноглобулинов человека нормального показано отсутствие вируснейтрализующей активности.

Таким образом, гипотеза о возможной кроссреактивности сезонных коронавирусов с

SARS-CoV-2 подтвердилась частично, что в большей степени обосновывает необходимость поиска простого метода определения вируснейтрализующих антител в образцах.

3.3Создание Банка образцов

Для проведения исследования с целью выявления корреляционной зависимости между результатами определения антител к SARS-CoV-2 в сыворотках крови человека с помощью методов ИФА и РВН требуется значительное количество образцов для осуществления статистически достоверных расчетов.

На момент выполнения работ приобрести панель образцов, охарактеризованных в РВН,

не представлялось возможным. Для получения такой панели требовалось в первую очередь создать банк образцов, а затем охарактеризовать данные образцы по содержанию вируснейтрализующих антител в РВН.

Для проведения исследования в первую очередь был Создан Банк Образцов, включающий

2 группы пациентов:

-здоровых доноров, без признаков ОРВИ в последние 6 месяцев с момента забора крови,

-доноров, перенесших COVID-19 в последние 3 месяца с момента забора крови

(реконвалесцентов).

При включении образцов в группу здоровых доноров использовали следующие специфические критерии:

- отрицательный результат лабораторного исследования на наличие РНК SARS-CoV-2

методом полимеразной цепной реакции (ПЦР);

- отсутствие на протяжении последнего года явлений ОРВИ, ОРЗ, ангины, пневмонии вирусной и/или бактериальной этиологии.

В данную группу вошли 1110 образцов, собранных в период 2018-2019 гг.,

предоставленных учреждениями службы крови РФ.

60

При включении образцов в группу реконвалесцентов использовали следующие специфические критерии:

- положительный результат лабораторного исследования на наличие РНК SARS-CoV-2

методом ПЦР в образце соскоба клеток ротоглотки вне зависимости от клинических проявлений и последующий отрицательный результат лабораторного исследования на наличие РНК SARS- CoV-2 методом ПЦР перед забором образца крови.

Всего было собрано 389 образцов, 237 образцов было заготовлено самостоятельно, также

152 образца, было предоставлено ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи».

Таким образом, всего в Банк Образцов было собрано 1499 образцов в двух группах.

Перечень образцов представлен Приложении Н.

3.4 Исследование Банка образцов на содержание антител в РВН и методом ИФА

Было проведено исследование наличия антител, специфичных к SARS-СoV-2 в 1499

образцах Банка Образцов. Исследование каждого образца проводилось согласно инструкции соответствующей тест-системы. Исходя из методик, описанных в инструкции, были рассчитаны полуколичественные показатели оценки содержания антител, специфичных к SARS-СoV-2 -

коэффициенты позитивности (КП). Для тех случаев, когда согласно инструкции, требовалась постановка в 2 повторах, результаты представлены в виде средних арифметических.

3.4.1 Определение титра вируснейтрализующих антител в образцах Банка

образцов

Проведено исследование наличия ВНА в образцах крови. Так как сложность выполнения данного тестирования является крайне существенной, отсутствовала возможность проведения РВН во всех 1499 образцах.

Отбор образцов на РВН проводился следующим образом: 1499 образцов были проанализированы методом ИФА с использованием всех имеющихся наборов реагентов. Далее в РВН были проанализированы все образцы, положительные хотя бы в одной из использованных тест-систем. В РВН были проанализированы также образцы, отрицательные по результатам тестирования с использованием методом ИФА.

Таким образом, в РВН были проанализированы 559 образцов, из них:

-418 образцов, положительных в ИФА,

-141 образец, отрицательный в ИФА.

3.4.2 Определение чувствительности и специфичности тест-систем ИФА на

выборке образцов Банка образцов

Чувствительность и специфичность являются основными статистическими показателями

для диагностических тестов, в том числе для тест-систем ИФА.