Структура гена. Экзоны, интроны, регуляторные области, спейсеры. (дубль)
Регуляторные последовательности расположены на концах генов. Эти последовательности могут быть либо рядом с транскрибируемой областью
промотор, либо разделены множеством тысяч оснований - энхансеры и сайленсеры.
Промотор
расположен на 5'-конце гена. Он является
местом начала
транскрипции,
связывая
РНК-полимеразу,
факторы
транскрипции
и
другие
белки.
Экспрессия генов может регулироваться множеством энхансеров и сайленсеров, которые дополнительно модифицируют активность промоторов. Энхансеры и сайленсеры могут быть расположены далеко от гена, на расстоянии многих тысяч пар оснований.
До (с 5’ - конца) и после (с 3’-конца) кодирующей части гена расположены UTR-области или нетранслируемые области, которые содержат дополнительные регуляторные последовательности.
До нетранслируемой области с 5’-конца в генах человека расположен участок, обогащенный А и Т - ТАТА-бокс. С ним связываются транскрипционные факторы, привлекающие РНК-полимеразу к сайту начала транскрипции.
Между генами расположены спейсеры.
Принцип и применение полимеразной цепной реакции ..
это экспериментальный метод, направленный на многократное копирование (амплификацию) определенных фрагментов ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов)
Необходимо:
Анализируемая копия ДНК массой 2 нанограмма (нг)
комплементарный олигонуклеотидные праймеры ограничивающие участок ДНК
новые дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNTP = dATP+dTTP+dGTP+dCTP)
фермент TaqДНК-полимераза (остается активной при 100 гр.Цельсия) обеспечивает достраивание З'-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности.
Среда буфер: калий, магний, сульфат аммония
консольвенты – вещества поддерживающие ДНК в одноцепочечном состоянии (DMSO)
доводят до нужного объема деионизированной водой
Цикл:
Денатурация (97-98 градусов)
– это переход ДНК из двухнитевой формы в однонитевую при разрыве водо-
родных связей между комплементарными парами оснований под воздействием высоких температур
Отжиг (гибридизация на специфических последовательностях) от 52-70℃ зависит от того каким локусом становится – отжиг
58℃
- это присоединение праймеров к одноцепочечной ДНК-мишени. Праймеры подбирают так, что они ограничивают искомый фрагмент и комплементарны противоположным цепям ДНК. Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа. Если это условие не соблюдено, то отжига праймеров не происходит.
Элонгация (синтез) - 72℃
После отжига праймеров Taq-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК с 3'-конца праймера.
1 цикл: 5:1:1
29 циклов: 0,5:1:1
Последний: 0,5:1:7
Последующие повторы приводят к множественной амплификации ДНК в процессе количество копий увеличивается с одной до 10^9
Накопление нужного фрагмента идет по экспоненте, где n – число циклов 2n-2n
Праймер – одноцепочечный искусственно синтезируемый фрагмент ДНК Длина 20-30 нуклеотидов, содержит C и G не более 65%, прямой и обратный праймер не должны содержать длинных последовательностей комплементарных друг другу (иначе возможно образование петель и димеров), ориентирутся так, чтобы синтез протекал между ними
Должен быть специфичными. Особое внимание уделяют 3'-концам праймеров, так как именно с них Taq-полимераза начинает достраивать комплементарную цепь ДНК. Если их специфичность недостаточна, то
высока вероятность, что в пробирке с реакционной смесью будут происходить процессы неспецифического связывания, и синтеза фрагментов различной длинны, отличных от искомых. Часть праймеров и дНТФ расходуется на синтез неспецифической ДНК, что приводит к значительной потере чувствительности.
Виды ПЦР: реал-тайм, гнездовая, аллель специфичная, метил- чувствительная
Применение: диагностика инф.заболеваний, наследственных и онкологических заболеваний, научные исследования, определение родства,
криминалистика, в пищевой промышленности