1. Поверхностные структуры:

- капсула

- клеточная стенка

- ЦПМ

- жгутики, ворсинки

2. Внутренние, входящие в протопласт.

- нуклеоид,

- рибосома,

- мезосома

-споры,

-включения,

-плазмиды и др. внехромосомные генетические структуры

Постоянные структуры:

– клеточная стенка,

- ЦПМ,

- нуклеоид, рибосома, мезосома

2. Непостоянные структуры:

- ворсинки, жгутики, капсула, споры, включения, плазмиды и др. внехромосомные генетические структуры

Особенности клеточной стенки грамположительных бактерий.

Мощная, толстая, несложно организованная клеточная стенка, в составе которой преобладают пептидогликан и тейхоевые кислоты, нет липополисахаридов (ЛПС), часто нет диаминопимелиновой кислоты.

Особенности клеточной стенки грамотрицательных бактерий.

Клеточная стенка значительно тоньше, чем у грамположительных бактерий, содержит ЛПС, липопротеины, фосфолипиды, диаминопимелиновую кислоту. Устроена более сложно- имеется внешняя мембрана, поэтому клеточная стенка трехслойная.

11.Строение клеточной стенки у грамположительных и грамотрицательных микробов. Отличительные признаки этих микроорганизмов. Протопласты и сферопласты.

Особенности клеточной стенки грамположительных бактерий Клеточная стенка грамположительных бактерий однослойная, представлена 5-6 рядами пептидогликана (до 90% сухой массы клеточной стенки). В пептидогликан погружены и выходят на поверхностьтейхоевые кислоты(до 50% сухого веса ее). Тейхоевые кислоты— растворимые в воде линейные полимеры, содержащие остатки глицерина или рибитола (глицеринтейхоевые и рибиттейхоевые).Тейхоевые кислоты — главные поверхностные антигены многих грамположительных бактерий. Они в значительном количестве располагаются между цитоплазматической мембраной и слоем пептидогликана, и через поры в нем выступают наружу. функция тейхоевых кислот полностью не выяснена. Считается, что тейхоевые кислоты придают муреиновому мешку определенную степень свободы при растяжении и сжатии и действуют наподобие пружины.

Клеточная стенка большинства грамположительных бактерий не содержит липидов, однако у микобактерий и коринебактерий в ней имеются токсические гликолипиды.Особенность пептидогликанов грамположительных бактерий — частое отсутствие в них диаминопимелиновой кислоты.В клеточной стенке грамположительных бактерийотсутствуют липополисахариды; содержание белка в них сильно варьирует. Белки во многом определяют антигенную специфичность таких бактерий. Например, стрептококки серогруппы А по белкам М и Т подразделяют на несколько десятков серотипов.

Особенности клеточной стенки грамотрицательных бактерий  Клеточная стенкаграмотрицательных бактерийзначительно тоньше (14—18 нм) и состоит из двух слоев. Первый - представленодним или двумярядамипептидотликана,на долю которого приходится до 5—10% сухого веса стенки. Для пептидогликана характерно низкое содержание поперечных сшивок между пептидными цепочками, однако в нем почти всегдаимеется диаминопимелиновая кислота. В составе клеточной стенки содержится много липопротеинов, фосфолипидов, липополисахарид, больше белка и, как правило, отсутствуют тейхоевые кислоты.Второй слой – бислой фосфолипидов, пронизанный транспортными белками, в нем крепиться липополисахарид (ЛПС). ЛПС – включает в себя три компонента: 1. Липид А – крепит данную структуру в бислое фосфолипидов и является наиболее токсичным компонентом (эндотоксин). 2 – ядро – одинаковое у всех Гр-. 2. Полисахарид – О-специфическая цепь полисахарида – несет антигенную функцию (О-АГ).

Между клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной находится периплазматическое пространство, или периплазма, содержащая ферменты (протеазы, липазы, фосфатазы,нуклеазы, бета-лактамазы), а также компо­ненты транспортных систем.

Способность грамположительных бактерий при окраске по Граму удерживать генциановый фиолетовый в комплексе с йодом (сине-фиолетовая окраска бактерий) связана со свойством многослойного пептидогликана взаимодействовать с красителем. Кроме этого, последующая обработка мазка бактерий спиртом вызывает суживание пор в пептидогликане и тем самым задерживает краситель в клеточной стенке. Грамотрицательные бактерии после воздействия спиртом утрачивают краситель, что обусловлено меньшим количеством пептидогликана (5—10 % массы клеточной стенки); они обесцвечиваются спиртом и при обработке фуксином приобретают красный цвет.

При нарушении синтеза клеточной стенки бактерий под влиянием лизоцима, пенициллина, защитных факторов организма и других соединений образуются клетки с измененной (часто шаровидной) формой: протопласты — бактерии, полностью лишенные клеточной стенки;сферопласты — бактерии с частично сохранившейся клеточной стенкой. После удаления ингибитора клеточной стенки такие измененные бактерии могут реверсировать, т. е. приобретать полноценную клеточную стенку и восстанавливать исходную форму

Протопласты – формы прокариот, полностью лишенные клеточной стенки, образуются обычно у грам «+» бактерий.Сферопласты– бактерии с частично разрушенной клеточной стенкой. Наблюдаются чаще у грам «-» бактерий, реже у грам «+». Образуются в результате разрушения пептидогликанового слоя литическими ферментами: например, лизоцимом или блокирование биосинтеза пептидогликана антибиотиками, например, пенициллином в среде с соответствующим осмотическим давлением. Протопласты и сферопласты имеют сферическую форму или полусферическую, и в 3-10 раз крупнее исходных клеток. В обычных условиях наступает осмотический лизис и они погибают.

L-формы бактерий– это фенотипические модификации, или мутанты бактерий, частично или полностью утратившие способность синтезировать пептидогликан клеточной стенки.

12. Капсула и цитоплазматическая мембрана, их строение, химический состав, функции. Методы выявления.

Капсула- слизистый слой клеточной стенки бактерий, состоящий из полисахаридов (пневмококк) или полипептидов (бацилла сибирской язвы). Микрокапсулу (толщиной менее 0,2 мкм) способны формировать большинство бактерий, четко выраженную макрокапсулу (толщиной более 0,2 мкм) формируют пневмококк, клебсиеллы, возбудитель сибирской язвы и некоторые другие. У патогенных бактерий капсула образуется в макроорганизме, на искусственных питательных средах она обычно утрачивается (за исключением клебсиелл).

В организме человека и животных капсула защищает патогенные бактерии от бактериофага, фагоцитоза и гуморальных факторов иммунитета, определяет антигенную специфичность микроорганизмов.

Капсулы, имея консистенцию геля, плохо удерживают краситель, и для их выявления чаще всего применяют методы негативного контрастирования.

Метод выявления капсулы по Бурри-Гинса

На середину предметного стекла наносят каплю черной туши и смешивают ее с помощью петли с каплей культуры капсульных бактерий.

Краем другого предметного стекла делают мазок по типу кровяного. Мазок сушат на воздухе и фиксируют в пламени горелки.

Окрашивают 5 мин карболовым фуксином, разведенным водой 1:3.

Осторожно промывают водой, высушивают.

Бактерии окрашиваются в красный цвет, неокрашенные капсулы контрастно выделяются на темном фоне препарата.

Цитоплазма каждой клетки окружена мембраной, которая ограничивает ее от окружающей среды. Цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) является исключительно полифункциональной структурой:

1.ЦПМвоспринимает всю химическую информацию, поступающую в клетку из внешней среды.

2.Она является основным осмотическим барьером, благодаря которому внутри клетки поддерживается определенное осмотическое давление.

3.ЦПМ совместно с клеточной стенкой участвует врегуляции роста и клеточного деления бактерий.

4.ЦПМ участвует в регуляции процессов репликации и сегрегации хромосом и плазмид (они связаны с ее рецепторами).

5. В ЦПМ содержится значительное количество ферментов, в том числе системы переноса электронов (ЦПМ— место генерации энергииу бактерий).

6.С ЦПМ связаны жгутикии аппарат регуляции их движения.

7.ЦПМ участвует в процессах транспорта (в том числе активного) питательных веществ в клетку и продуктов жизнедеятельности, включая ферменты и экзотоксины, из клетки в окружающую среду. В ней содержатся белки, участвующие в облегченной диффузии и активном транспорте

.8.ЦПМ играет важную роль в компартментализации и стабилизации рибосом. 9.ЦПМ участвует в синтезе компонентов клеточной стенки. 10.ЦПМ участвует в образовании мезосом (мезосомы образуются в результате инвагинации участка ЦПМ в цитоплазму, они открыты в периплазматическое пространство).

Методы выявления капсул, жгутиков, спор

Для выявления некоторых бактерий и отдельных структур клеток применяют специальные методы окраски.

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена:

1. На фиксированный мазок наносят карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогревают до появления паров в течение 3-5 минут.

2. Снимают бумагу, промывают мазок водой.

3. На мазок наносят 5% раствор серной кислоты или 3% раствор солянокислого спирта на 1-2 минуты для обесцвечивания.

4. Промывают водой.

5. Докрашивают мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 минут.

6. Промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Выявление капсулы по методу Гинса:

1. На предметное стекло наносят каплю туши, а рядом – каплю исследуемого материала. Обе капли тщательно перемешивают и с помощью шлифованного стекла готовят мазок.

2. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют на пламени горелки.

3. Мазок окрашивают фуксином в разведении 1:3 или сафранином. При этом бактерии окрашиваются в красный цвет, капсулы остаются неокрашенными и выделяются на темном фоне препарата.

13. Жгутики микробов. Строение, значение, методы обнаружения подвижных микробов. Особенности строения жгутиков у грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

Все бактерииподразделяются на подвижные и неподвижные. Органами движения у бактерий являются жгутики. Они состоят из белка флагеллина, который по своей структуре относится к сократительным белками типа миозина.

Основанием жгутикаявляется базальное тельце, состоящее из системы дисков (блефаропласта: 1 диск - наружная сторона клеточной стенки, 2 диск - внутренняя сторона клеточной стенки, 3 диск - цитоплазматическая мембрана), "вмонтированных" в цитоплазматическую мембрану и клеточную стенку. Длина жгутика больше длины тела самого микроба. По числу жгутикови их расположению подвижные микроорганизмы подразделяются на:

1. Монотрихи, имеющие на конце тела один жгутик (самые подвижные). Например, Vibrio cholerae.

2. Лофотрихи, имеющие пучок жгутиков на одном из полюсов клетки. Например, Burkholderia (Pseudomonas) pseudomalei - возбудитель мелиоидоза. 3. Амфитрихи, имеющие жгутик на обоих полюсах клетки. Например, Spirillum volutans. 4. Перитрихи, имеющие жгутики по всему периметру клетки. Например, Escherichia coli, Salmonella typhi.

Выявление жгутиков. Жгутики очень тонкие, поэтому их можно обнаружить только при специальной обработке. В частности, вначале при помощи протравы достигается разбухание и увеличение их размера, а затем производится окраска препарата, благодаря чему они становятся видимыми при световой микроскопии. Выявлять жгутики можноокраской по Морозову, Леффлеру, а также электронной микроскопией. Обнаружить жгутики можно и по активной подвижности бактерий.

Движение микробов наблюдают в препаратах "раздавленной" и "висячей" капли из живых культур. Микроскопируют эти препараты сухим или иммерсионным объективом в темном поле или в фазовом контрасте. Кроме того, подвижность можно определить по характеру роста бактерий в полужидком агаре.

Жгутики выявляют с помощью электронной микроскопии препаратов, напыленных тяжелы­ми металлами, или в световом микроскопе после обработки специальными методами, основанны­ми на протравливании и адсорбции различныхвеществ, приводящих к увеличению толщины жгутиков (например, после серебрения).

Жгутик состоит из трех частей: нити, крюка и базального тельца (рис. 2). С помощью базального тельца, в которое входит центральный стержень и кольца, жгутик закреплен в цитоплазматической мембране и клеточной стенке. Количество колец у грамотрицательных и грамположительных бактерий различно. У грамотрицательных бактерий имеются четыре кольца: L, P, S, M. Из них L и P – наружная пара колец; S и M внутренняя пара колец. L-кольцо закреплено в наружной мембране, P – в пептидогликановом слое клеточной стенки, S – в периплазматическом пространстве, а M – в цитоплазматической мембране. У грамположительных бактерий базальное тельце устроено проще. Оно состоит только из двух колец: S и M, т. е. только из внутренней пары колец, которые размещаются в цитоплазматической мембране и клеточной стенке.

14. Споры бактерий. Процесс спорообразования и прорастания спор. Методы выявления спор. Значение спорообразования. Отличие спор бактерий и грибов.

Споры —своеобразная форма покоящихся бактерий с грамположительным типом строе­ния клеточной стенки (рис.).

Споры образуются при неблагоприятных условиях существования бактерий (высуши­вание, дефицит питательных вешеств и др.). Внутри бактериальной клетки образуется одна спора (эндоспора). Образование спор способствует сохранению вида и не является способом размножения, как у грибов.

Спорообразующие бактерии рода Bacillus, у которыхразмер споры не превыша­ет диаметр клетки, называются бациллами.Спорообразующие бактерии, у которыхраз­мер споры превышает диаметр клетки, отчего они принимают форму веретена, называют­ся клостридиями,например бактерии родаClostridium (лат.clostridium — веретено).Споры кислотоустойчивы, поэтому окрашиваются по методу Ауески или по методу Циля—Нельсена в красный, а вегетативная клетка — в синий.

Спорообразование, форма и расположение спор в клетке (вегетативной) являются ви­довым свойством бактерий, что позволяет отличать их друг от друга.

Форма спор может быть овальной, шаровидной;расположение в клетке:

1. терминальное,т. е. на конце палоч­ки (у возбудителя столбняка),

2. субтерминаль­ное — ближе к концу палочки (у возбудителей ботулизма, газовой гангрены)

3. центральное (у сибиреязвенной бациллы).

Процесс спорообразованя (споруляция) прохо­дит ряд стадий, в течение которых часть цитоп­лазмы и хромосома бактериальной вегетатив­ной клетки отделяются, окружаясь врастающей цитоплазматической мембраной, — образуетсяпроспора.

Проспору окружают две цитоплазматические мембраны, между которыми формиру­ется толстый измененный пептидогликановый слой кортекса (коры). Изнутри он соприкаса­ется с клеточной стенкой споры, а снаружи — с внутренней оболочкой споры. Наружная обо­лочка споры образована вегетативной клеткой.

Споры некоторых бактерий имеют дополни­тельный покров — экзоспориум.

Таким образом формируется многослойная плохо проницаемая оболочка. Спорообразование сопровождается интенсивным потреблением проспорой, а затем и формирующейся оболочкой споры дипиколиновой кислоты и ионов кальция. Спора приоб­ретает термоустойчивость, которую связывают с наличием в ней дипиколината кальция.

Спора долго может сохраняться из-за нали­чия многослойную оболочки, дипиколината кальция, низкого содержания воды и вялых процессов метаболизма. В почве, например, возбудители сибирской язвы и столбняка мо­гут сохраняться десятки лет.

В благоприятных условиях споры прораста­ют, проходя три последовательные стадии :

1.активацию

2. инициацию

3. вырастание

Спорообразование- это способ сохранения вида (генофора) во внешней среде при неблагоприятных условиях, а не способ размножения.

Споры образуютсяпри неблагоприятных условиях существования бактерий (высуши­вание, дефицит питательных веществ и др.). Внутри бактериальной клетки образуется одна спора (эндоспора).

Стадии спорообразования

1. Подготовительная. В цитоплазме бактерий образуется уплотненный участок, не имеющий свободной воды, называемый "спорогенной зоной", в которой содержится нуклеоид.

2. Стадия предспоры (проспоры). Вокруг спорогенной зоны образуется оболочка из двойной цитоплазматической мембраны.

3. Образование кортекса, состоящего из пептидогликана и наружной мембраны с повышенным содержанием солей кальция и липидов.

4. Стадия созревания. С внешней стороны наружной мембраны образуется оболочка споры, после чего вегетативная часть клетки лизируется, освобождая спору.

Расположение в клетке: терминальное (у возбудителя столбняка), субтерминальное (ботулизм, газовая гангрена), центральное (сибиреязвенная бацилла)

Выявление: Споры можно обнаружить в бактериальной клетке специальной окраской по методу Ауески (при микроскопии споры ярко-красного цвета, вегетативные тела бактерий - синего), или с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Этапы окраски по Ауески.

1. На нефиксированный мазок нанести 0,5% р-р хлороводородной кис-ты и подогреть на пламени в течении 2-3 мин

2. Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем. Затем окрасить по Цилю-Нельсену.

* Споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы - синий.

При этом из одной споры образуется одна бактерия.

Активация —это готовность к прорастанию. При температуре 60—80°С спора активируется для прорастания.

Инициацияпрорастания длит­ся несколько минут. Стадия вырастания характе­ризуется быстрым ростом, сопровождающимся разрушением оболочки и выходом проростка

ОТЛИЧИЕ Грибные споровидные тела выполняют исключительно функцию размножения. Им свойственно изменять свою форму в течение жизненного цикла. Такая способность известна под определением "плеоморфизм". Проявляется это в наличии у грибов одновременно нескольких типов спор, которые различаются по способу деления. Споры грибов, в отличие от спор бактерий, формируются в различных местах: грибы, которые размножаются с помощью образования мицелия, производят хламидоспоры и артроспоры; внутри спорангий, что формируются низшими представителями царства грибов, продуцируются спорангиоспоры; у высших грибов споры образуются на поверхности трубочковидных и пластинчатых тел. грибами споры производятся в целях размножения. В случае с бактерией речь идет, скорее, о трансформации живой клетки, что позволяет ей выживать в неблагоприятных условиях. Как показывают результаты научных исследований, отдельные бактериальные споры способны противостоять температурным, атмосферным, химическим и механическим нагрузкам, которые являются катастрофическими для клеток животных, растений и тех же грибов. Это и есть определяющее отличие споры гриба от споры бактерии. Стоит отметить, что далеко не все представители царства бактерий обладают способностью к трансформации в защитные споры. Подвластна возможность лишь палочковидным формам данной категории организмов. Бактерии этого типа широко известны под определением "бациллы". Споры палочковидных микроорганизмов образуются на протяжении суток. Активизация процесса происходит в ответ на возникновение непригодных для существования и ведения активной жизнедеятельности условий. Такой метод защиты от факторов окружающей среды является крайне действенным. В виде спор бациллы способны существовать в неактивной форме на протяжении нескольких десятилетий. Защитные оболочки бактериальных спор становятся невосприимчивы к отсутствию влаги. Они выдерживают различные виды облучения, в том числе радиационное.

15. Включения у микроорганизмов, их значение. Методы обнаружения включений.

В цитоплазмеимеются различные включе­ния в виде гранул гликогена, полисахаридов, бета-оксимасляной кислоты и полифосфатов (волютин). Они накапливаются при избытке питательных веществ в окружающей среде и выполняют роль запасных веществ для пита­ния и энергетических потребностей.

Волютинобладает сродством к основным красителям и легко выявляется с помощью специальных методов окраски (например, по Нейссеру) в виде метахроматических гранул. Толуидиновым синим или метиленовым голу­бым волютин окрашивается в красно-фиоле­товый цвет, а цитоплазма бактерии — в синий. Характерное расположение гранул волютина выявляется у дифтерийной палочки в виде ин­тенсивно прокрашивающихся полюсов клетки. Метахроматическое окрашивание волютина связано с высоким содержанием полимеризо-ванного неорганического полифосфата. При электронной микроскопии они имеют вид элек­тронно-плотных гранул размером 0,1—1,0 мкм.

Примеры микроорганизмов, имеющих зерна волютина: - Spirillum volutans - сапрофит - Corynebacterium xerosis - нормальный обитатель глаз - Corynebacterium diphtheriae - возбудитель дифтерии (расположены полюсно) - Corynebacterium ulcerans - возбудитель дифтериеподобных поражений кожи

16. Техника приготовления мазка. Окраска по методу Х. Грама. Отличительные признаки грамположительных и грамотрицательных бактерий